Post-fissazione con soluzione di Bouin, un alternativa per le biopsie
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Post-fissazione con
soluzione di Bouin, un
alternativa per le biopsie
osteomidollari?
Jasmin Zampedri
Scuola Superiore Medico-Tecnica, Locarno
Giugno 2008
Lavoro svolto presso l’Istituto cantonale di Patologia di
Locarno Responsabile Prof. Dr. Med. Mazzucchelli
INDICE
1. RIASSUNTO..................................................................................................................................3
2. INTRODUZIONE...........................................................................................................................4
2.1 INTRODUZIONE PERSONALE..............................................................................................4
2.2 INTRODUZIONE GENERALE................................................................................................4
3. OBIETTIVI......................................................................................................................................5
4. MATERIALE E METODI ..............................................................................................................6
4.1 MATERIALE BIOLOGICO......................................................................................................6
4.2 FISSAZIONE.............................................................................................................................6
4.3 SOLUZIONE DI BOUIN ..........................................................................................................7
4.4 DECALCIFICAZIONE .............................................................................................................7
4.5 COLORAZIONI ........................................................................................................................7
4.5.1 Ematossilina-eosina ............................................................................................................8
4.5.2 Blu di Prussia ......................................................................................................................8
4.5.3 Gomori ................................................................................................................................8
4.5.4 Giemsa con micro-onde ......................................................................................................8
4.6 METODOLOGIA ......................................................................................................................9
4.6.1 Generale ..............................................................................................................................9
4.6.2 Reperimento dei campioni ..................................................................................................9
4.6.3 Post-fissazione in Bouin......................................................................................................9
4.6.4 Decalcificazione..................................................................................................................9
4.6.5 Disidratazione dei tessuti ....................................................................................................9
4.6.6 Taglio delle sezioni ...........................................................................................................10
4.6.7 Colorazione delle sezioni ..................................................................................................10
4.6.8 Valutazioni delle colorazioni ............................................................................................10
4.6.9 Immagini ...........................................................................................................................10
4.7 METODO DI VALUTAZIONE..............................................................................................10
5. RISULTATI...................................................................................................................................12
5.1 RISULTATI TEST 1 ...............................................................................................................12
5.2 RISULTATI TEST 2 ...............................................................................................................13
5.3 PRIME DISCUSSIONI............................................................................................................15
5.4 RISULTATI TEST 3 ...............................................................................................................16
5.5 RISULTATI TEST 4 ...............................................................................................................18
6. DISCUSSIONI .............................................................................................................................21
7. CONCLUSIONI ...........................................................................................................................22
8. RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................23
9. BIBLIOGRAFIA ...........................................................................................................................24
9. ALLEGATI....................................................................................................................................25
9.1 RICETTA SOLUZIONE DI BOUIN ......................................................................................25
9.2 DECALCIFIER MILD ............................................................................................................30
9.3 PROTOCOLLI COLORAZIONI ............................................................................................32
9.4 TABELLA RIASSUNTIVA DELLE PROCEDURE .............................................................34
9.5 PROTOCOLLO DISIDRATAZIONE.....................................................................................35
9.6 MODULO CONTROLLO DI QUALITÀ...............................................................................36
Zampedri Jasmin 2/36
1. RIASSUNTO: 1. ABSTRACT: Introduzione: Introduction: L'istologia è un’importante branca della medicina, Histology is an important branch of medicine, della chirurgia e della biologia; essa studia la surgery and biology. It studies the tissues and the morfologia dei tessuti e le cellule che li cells they are made of, from a morphological and a compongono, sia da un punto di vista morfologico functional point of view. Each morphological detail is sia funzionale. of high importance for a good diagnosis in this field. In questo campo ogni dettaglio morfologico della The Bouin solution is known for its specific ability to cellula é di rilevante importanza per una buona show excellent cytological details. Until now, no diagnosi da parte del medico patologo. other solutions have been found which can provide La soluzione di Bouin è conosciuta per la capacità di such good results. fornire ottimi dettagli citologici, meglio di ogni altro As described in the literature, the Bouin solution is liquido fissativo. normally used as primary fixative: the biological La letteratura descrive eccellenti risultati soprattutto tissues are kept in the Bouin solution for no more se utilizzata come fissativo primario. A questo than 24 hours. Currently, the shipping modalities of proposito la permanenza dei tessuti biologici nella the biological tissues at the Istituto Cantonale di soluzione di Bouin non dovrebbe superare le 24 ore, Patologia (ICP) often do not satisfy these conditions. ma le attuali modalità di spedizione dei tessuti The importance of improving cytological details is biologici presso l’Istituto Cantonale di Patologia the reason why this work considered aspects of the (ICP) spesso non permettono di rientrare entro tali post-fixation (secondary fixation) of the bone raccomandazioni. marrow’s biopsies with the Bouin solution. Bone L’importanza di evidenziare anche piccoli marrow has been chosen as a model, because of its miglioramenti dei dettagli citologici ha giustificato il complex morphology, where even minimal details tentativo di questo lavoro di valutare alcuni aspetti are essential for a correct diagnosis. della post-fissazione (fissazione secondaria) delle Materials and methods: biopsie osteomidollari con la soluzione di Bouin. La The biopsies large enough to have sufficient scelta di questo particolare tipo di tessuto è dettata material to perform the conventional and the new dall’estrema importanza per il medico patologo di staining were chosen. poter osservare la morfologia nel dettaglio. First, the one half of each biopsy sample was Materiale e metodi: differently post-fixed with the Bouin solution before I campioni biologici raccolti per le valutazioni sono decalcification and before the tissues was rappresentati dalle biopsie osteomidollari; i criteri di completely dehydrated. scelta sono stati limitati dalla quantità di materiale in Successively, the tissues were treated with the modo da permettere la lavorazione delle biopsie con Bouin solution only after they were cut on il metodo attuale parallelamente al metodo in microscope glass, just before staining. discussione. The cytomorphology of the different sections was In una prima fase la metà di ogni campione valutato evaluated by different pathologists of the institute ha subito una post-fissazione variabile in soluzione according to fixed criteria listed in an appropriate di Bouin prima della decalcificazione e della totale formulary. The considered stains were hematoxylin- disidratazione del tessuto. Successivamente, i eosin, Prussia’s blue, Gomori and Giemsa. tessuti sono stati trattati con soluzione di Bouin dopo Results: essere tagliati sui vetrini, prima di procedere alla Staining of the bone marrow’s biopsies after the colorazione. postfixation in the Bouin solution was evaluated as La citomorfologia delle differenti sezioni è stata unsatisfying by the pathologists. Although multiple valutata da differenti medici patologi dell’istituto per variation in the fixation’s duration and the in steps of mezzo di un formulario appositamente creato con the staining procedure were performed, none of the precisi criteri prestabiliti. Le colorazioni prese in considered samples were as good as the current considerazione sono state l’ematossilina-eosina, il staining method. blu di Prussia, il Gomori e il Giemsa. Risultati: Le valutazioni da parte dei medici patologi delle colorazioni eseguite dopo post-fissazione in Bouin sulle sezioni di biopsie osteomidollari mostrano che non vi è stato nessun miglioramento anche con la variazione della durata e nella sequenza all’interno della procedura. Tutte le colorazioni prese in considerazione hanno ottenuto delle valutazioni peggiori rispetto al metodo attuale. Zampedri Jasmin 3/36
2. INTRODUZIONE 2.1 INTRODUZIONE PERSONALE Nel corso della formazione TAB presso la scuola superiore medico-tecnica di Locarno ho effettuato uno stage pratico di sei mesi all’ Universitätsspital di Zurigo. Il tipo di lavoro svolto durante questo periodo mi ha stimolato ad informarmi sulla possibilità di effettuare il lavoro di diploma proprio in questo specifico campo. Confermata questa opportunità da parte della scuola, ho contattato i responsabili dell’istituto cantonale di patologia di Locarno per pianificare un incontro necessario a discutere gli eventuali temi del lavoro di diploma. Il tema scelto soddisfaceva sia le esigenze attuali del laboratorio di istologia, sia le mie esigenze personali. 2.2 INTRODUZIONE GENERALE La struttura delle singole componenti di un tessuto è di fondamentale importanza nell’istopatologia clinica per formulare delle corrette diagnosi. Immediatamente dopo il prelievo, i tessuti biologici vanno incontro ai naturali processi di autolisi. La fissazione, procedimento che serve a conservare integro un tessuto evitandone l’auto-distruzione, è essenziale e determina la qualità di tutte le procedure successive[1]. La letteratura descrive eccellenti risultati della colorazione ematossilina-eosina (H&E), specialmente a livello della preservazione delle strutture nucleari e cellulari, ottenuti dopo fissazione dei campioni biologici, tra cui le biopsie osteomidollari (bom), in soluzione di Bouin [2,3]. In effetti, alcuni laboratori di patologia svizzeri, ubicati all’interno di strutture ospedaliere (per esempio all’Institut für Pathologie, Kantonsspital St. Gallen), fissano le biopsie osteomidollari in questa soluzione immediatamente dopo il loro prelievo (fissazione primaria). La permanenza dei tessuti in questo fissativo non dovrebbe superare le 24 ore [4]. In caso contrario il tessuto inizia ad indurirsi rendendo difficile il suo sezionamento. L’istituto cantonale di patologia di Locarno (ICP) riceve i campioni biologici da tutti gli ospedali e cliniche presenti sul territorio ticinese e della Mesolcina. Le modalità di trasporto attuali rendono difficile il controllo preciso del tempo di permanenza dei campioni nel fissativo prima di giungere al laboratorio. È pertanto azzardato l’utilizzo della soluzione di Bouin come fissatore primario, in quanto è difficile rispettare con sicurezza le raccomandazioni in merito alla durata dell’incubazione massima dei tessuti in questa soluzione. L’incubazione dei tessuti biologici nella soluzione di Bouin primariamente fissati con formalina tamponata 4% (post-fissazione) [11] è una procedura utilizzata meno frequentemente in quanto i vantaggi dell’utilizzo di questa soluzione sono minori, lievi miglioramenti dei dettagli citomorfologici sono comunque riportati. Attualmente all’ICP la colorazione H&E eseguita sulle biopsie osteomidollari ottiene dei risultati soddisfacenti. Inoltre la società svizzera di controlli di qualità per l’istologia (www.swisshistotech.ch) conferma regolarmente la buona qualità della colorazione eseguita presso l’istituto. La possibilità di migliorare ulteriormente la procedura ha comunque stimolato il tentativo di introdurre l’utilizzo della soluzione di Bouin come post- fissatore. Il tessuto ematopoietico, osservato nel dettaglio nel corso dell’esame microscopico, è sembrato particolarmente idoneo per valutare l’impatto di questa nuova procedura; ogni piccolo miglioramento dei dettagli morfologici delle sezioni utilizzate per formulare le diagnosi è un passo importante nella qualità della cura del paziente. Zampedri Jasmin 4/36
3. OBIETTIVI L’obiettivo di questo lavoro di diploma consiste nel valutare le sezioni istologiche ottenute dalle biopsie osteomidollari post-fissate in soluzione di Bouin e nel confrontarle con quelle trattate con i metodi attualmente in uso all’ICP. La valutazione dell’impatto della post-fissazione comprende nel dettaglio la colorazione H&E, senza però escludere le altre tre colorazioni eseguite all’ICP nel corso della diagnosi delle biopsie osteomidollari: le colorazioni Giemsa, Gomori e blu di Prussia. Zampedri Jasmin 5/36
4. MATERIALE E METODI 4.1 MATERIALE BIOLOGICO Le biopsie osteomidollari hanno rappresentato il materiale utilizzato nel corso del lavoro di diploma; le biopsie, di lunghezza media di 3-4 cm provenienti dalla spina iliaca posteriore del bacino, sono composte da tessuto osseo e da tessuto ematopoietico. Il criterio di inclusione nello studio è stata la sufficiente quantità di materiale per portare a termine le manipolazioni a confronto; le biopsie osteomidollari sono infatti state divise in due parti dal medico patologo per permettere il paragone delle procedure sulla stessa biopsia. Idealmente si sarebbe dovuto dividere le biopsie longitudinalmente così da ottenere due parti equivalenti di tessuto confrontabile, ma la consistenza dura dello stesso, a quel momento non ancora decalcificato, ha escluso questa possibilità. Si è dunque optato per la divisione in senso trasversale. La parte con maggior quantità di tessuto osseo è sempre stata utilizzata per la procedura con incubazione in Bouin. Le biopsie osteomidollari sono un materiale molto prezioso a causa della difficoltà di prelievo e della tecnica particolarmente dolorosa per il paziente. Il numero limitato di biopsie osteomidollari utilizzate nel corso dello studio è giustificato dalla precarietà e dalla rarità del tipo di materiale. Le biopsie sono giunte all’ICP di Locarno già fissate in formalina tamponata al 4% per evitare il sopraggiungere di processi autolitici. 4.2 FISSAZIONE La fissazione è un passaggio essenziale a monte di ogni tecnica istologica in quanto permette di conservare la struttura delle singole cellule e dei tessuti in uno stato il più simile possibile a quello naturale, anche dopo la morte tessutale. Questa importante procedura, impedisce la rottura delle membrane delle cellule con conseguente liberazione nel citoplasma di enzimi autolitici che rompono le catene proteiche distruggendo i tessuti. Lo scopo della fissazione quindi è quello di impedire questi processi. Di fondamentale importanza é inoltre che il fissativo utilizzato, evitando l’autolisi, non alteri in alcun modo il resto del tessuto in esame. Il fissativo più utilizzato in istologia è la formalina tamponata al 4-8% che, grazie ad un elevato grado di diffusione, ha la capacità di penetrare profondamente nei tessuti senza produrre un eccessivo indurimento e senza precludere analisi successive. Un altro vantaggio è il suo costo contenuto che stabilisce un buon rapporto qualità-prezzo. La dimensione del materiale biologico determina il tempo di fissazione [1,4,5,6,10]. Vari fattori influenzano la riuscita di una buona fissazione, in particolare: • temperatura: la fissazione è consigliata a temperatura ambiente. Una fissazione a basse temperature porta invece a un rallentamento della fissazione e persistenza dell’autolisi; • taglia: la grandezza del tessuto è molto importante e in quanto la fissazione è legata alla penetrazione del fissatore. Un tessuto tagliato non dovrebbe superare i 5 mm di spessore; • grado di penetrazione: è definita come la capacità di un fissatore di penetrare nel tessuto senza danneggiarlo; • natura del fissatore: esistono vari tipi di fissatori: chimici, fisici, coagulanti, non coagulanti e ognuno di questi possiede una capacità differente nel tipo di fissazione.[1,4] Zampedri Jasmin 6/36
4.3 SOLUZIONE DI BOUIN
La soluzione di Bouin è considerata uno dei fissativi con la miglior capacità di preservare
le strutture delicate dei tessuti, delle componenti cellulari e di fornire ottimi dettagli
morfologici, fondamentali per una corretta diagnosi da parte del patologo [4].
Viene inoltre considerata ottima per la messa in evidenza del glicogeno e può essere
utilizzata come post-fissatore dopo che il tessuto è stato messo in formalina [2,11].
È principalmente composta da acido picrico e formolo ed è un fissativo cosiddetto
coagulante, siccome indurisce i tessuti permettendo una fissazione rapida. Visto l’alto
grado di penetrazione è consigliato anche per biopsie voluminose. Questo fissativo non
preclude alcun tipo di analisi e l’intenso colore giallo dovuto all’acido picrico che lo
caratterizza, non disturba le colorazioni; è sufficiente sciacquare i tessuti in alcool 70%,
successivamente in acqua corrente per eliminare la maggior parte del colore [2,4].
Le raccomandazioni in merito all’utilizzo di questo fissativo prevedono un’incubazione dei
tessuti biologici non superiori a 24 ore [4] in quanto oltre questa durata, i tessuti
cominciano ad indurirsi rendendo difficile la fase di taglio necessaria ad ottenere le sezioni
istologiche per le colorazioni.
La soluzione di Bouin ha inoltre un’azione distruttiva sugli eritrociti.
All’ICP la soluzione di Bouin viene utilizzata poco frequentemente nel corso di procedure
al di fuori dell’ambito considerato in questo studio. La soluzione è attualmente ricostituita
dai tecnici di analisi biomediche dell’ICP. Vista l’importanza di questa soluzione nell’ambito
di questo lavoro di diploma e per ottimizzare la standardizzazione della procedura, l’ICP
ha optato per l’acquisto di una soluzione di Bouin pronta all’uso [allegato 1].
4.4 DECALCIFICAZIONE
I tessuti impregnati di sali di calcio, come ad esempio le ossa, hanno una rigidità che li
rendono non idonei al taglio con il microtomo o per lo meno con i metodi classici. Per
ottenere delle sezioni istologiche di pochi micron di questi tessuti, è indispensabile
allontanare la matrice ossea, responsabile di questa rigidità, eliminando completamente la
componente inorganica; dopodichè, il tessuto osseo, conserva la struttura caratteristica
ma divenuto flessibile, può essere sezionato. Questo processo è chiamato
decalcificazione [7].
Le proprietà necessarie per un buon decalcificante si riassumono nelle seguenti:
• essere in grado di rimuovere completamente i sali di calcio dal campione in
esame
• evitare distorsioni a livello cellulare e del tessuto connettivo
• non influenzare negativamente le reazioni delle colorazioni
• efficacia in tempi accettabile.
La decalcificazione delle biopsie osteomidollari all’ICP avviene tramite incubazione di 24
ore a temperatura ambiente in una soluzione acida (RDF Mild Decalcifier) particolarmente
adatta a decalcificare materiale destinato alle colorazioni immunoistochimiche [allegato 2].
4.5 COLORAZIONI
La colorazione delle sezioni istologiche è necessaria a rendere visibile al microscopio con
chiarezza le varie componenti tessutali. La colorazione classica eseguita su tutte le sezioni
istologiche, è l`ematossilina-eosina (H&E).
Le colorazioni effettuate all’ICP per la diagnosi delle biopsie osteomidollari sono, oltre alla
colorazione di base H&E, la colorazione del blu di Prussia, la colorazione del Gomori e
quella del Giemsa.
Le colorazioni H&E, Gomori e blu di Prussia sono effettuate automaticamente negli
apparecchi Tissue Stainer TST44 della ditta Medite. Questi apparecchi dispongono di
bagni dove sono conservati i coloranti; un software permette di impostare la durata e la
sequenza delle incubazioni nei vari bagni. Il programma di ogni colorazione include
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l’idratazione delle sezioni prima della colorazione e la disidratazione una volta terminata la colorazione. La colorazione di Giemsa viene effettuata manualmente in quanto prevede un’incubazione nel micro-onde. 4.5.1 Ematossilina-eosina Questa colorazione bicromica permette un’osservazione generale dei tessuti. L’ematossilina è un comune colorante nucleare che viene isolato da un estratto di legno azzurro (Haemotoxylon campechianum). Essa colora i nuclei ed i substrati basofili producendo una colorazione blu. Allo stato puro non ha proprietà coloranti, ma viene facilmente ossidata ad emateina tramite maturazione; ciò può avvenire attraverso un processo naturale di esposizione all’aria ed alla luce per un periodo di 1-2 mesi, oppure con l’aggiunta di agenti ossidanti. L’emateina è anionica e non ha particolari affinità con gli acidi nucleici dei nuclei cellulari. Per conferire al composto una carica positiva è necessario aggiungere un mordente che va a formare, con l’emateina, una lacca relativamente insolubile (legame del mordente al colorante ed al tessuto). L’eritrosina e l’eosina sono i coloranti citoplasmatici più comunemente usati in istologia. Le loro proprietà acide permettono l’interazione con le proteine cellulari ricche di amminoacidi basici; il risultato è una colorazione citoplasmatica di colore rosso [1]. La colorazione automatica comprende l’idratazione e la disidratazione delle sezioni; la durata complessiva della procedura è di ventisette minuti [allegato 3]. 4.5.2 Blu di Prussia La colorazione blu di Prussia evidenzia la presenza di ferro ionizzato. Viene utilizzata nelle biopsie ostemidollari per visualizzare i depositi di ferro nei tessuti come l’emosiderina [1]. Il ferrocianuro di potassio, reagisce in ambiente acido con gli ioni ferrici dell’emosiderina formando un sale colorato, il blu di Prussia [8]. La colorazione automatica comprende l’idratazione e la disidratazione delle sezioni; la durata complessiva della procedura è di quarantadue minuti [allegato 3]. 4.5.3 Gomori Questa colorazione al nitrato d’argento viene utilizzata per evidenziare le fibre reticolari argirofile del tessuto connettivo che sono difficilmente riconoscibili con la colorazione H&E a causa della loro struttura molto fine. Questa colorazione applicata alle biopsie midollari è utile per la valutazione della fibre di precollagene, le quali sono alterate in numerosi malattie del tessuto ematopoietico [1,8]. La colorazione automatica comprende l’idratazione e la disidratazione delle sezioni; la durata complessiva della procedura è di cinquantadue minuti [allegato 3] 4.5.4 Giemsa con micro-onde La colorazione policromatica di Giemsa permette la differenziazione delle cellule presenti nel tessuto ematopoietico e l’identificazione del reticolo endoteliale, ma è pure usata per la messa in evidenza di microorganismi, in particolare di parassiti del tipo dei Toxoplasmi e delle Leishmanie e dei bacilli del tipo delle Rickettsie [8,9]. Questa colorazione prevede l’utilizzo di due coloranti in successione: 1) Soluzione di May Grünwald, che colora i nuclei in blu e il citoplasma basofilo in rosso- rosa. 2) Soluzione di Giemsa (composta da blu di metilene cloruro, blu di metilene eosinato, azzurro II eosinato) che aumenta l’intensità della colorazione nucleare e la capacità di evidenziare in modo selettivo gli elementi cellulari. Zampedri Jasmin 8/36
È importante ricordare che la cromatina delle cellule viene fortemente influenzata dal pH e che l’intensità della colorazione può variare in funzione dei tempi di differenziazione [8]. Questa colorazione viene eseguita manualmente in quanto prevede l’incubazione nella soluzione di Giemsa a caldo nel microonde [allegato 3]. 4.6 METODOLOGIA 4.6.1 Generale La procedura utilizzata per le biopsie osteomidollari, dal momento in cui arrivano all’ICP fino all’ottenimento dei tagli istologici necessari ai medici patologi per formulare la diagnosi, è composta da differenti fasi che vengono rispettate con precisione. Per identificare al meglio l’impatto della soluzione di Bouin con l’utilizzo di queste procedure, i differenti test effettuati durante la prima fase del lavoro hanno avuto come sola variabile il tempo d’incubazione nella soluzione, mentre tutte le altre fasi sono state mantenute identiche al metodo originale [allegato 4]. 4.6.2 Reperimento dei campioni Il reperimento dei campioni idonei è avvenuta nel corso dell’esame macroscopico in collaborazione con i medici patologi che sono stati informati dello studio in corso. Il criterio di inclusione è stato ben descritto nel capito 4.1. Il numero ridotto di biopsie osteomidollari incluso nello studio è giustificato, oltre che dalla precarietà del materiale, dal numero ridotto di questo tipo di biopsie che giungono all’ICP (poco più di cinquecento l’anno). Il periodo di stage presso il laboratorio di Locarno è stato di sole 12 settimane. Inoltre, tenendo conto del fatto che per seguire l’intera procedura di una biopsia sono necessarie 48 ore, il reperimento è stato limitato ai primi tre giorni della settimana. 4.6.3 Post-fissazione in Bouin La durata minima dell’incubazione in soluzione di Bouin utilizzata durante i test è il frutto di una ricerca in rete in merito all’argomento. La durata massima invece dalle raccomandazioni in merito all’utilizzo della soluzione. Nel corso dei primi test (TEST1, 2, 3) sono stati scelti tempi di incubazioni variabili in modo da identificare la durata che avrebbe permesso di ottenere i risultati più soddisfacenti. Nel corso del TEST4, l’incubazione in soluzione di Bouin è stata effettuata sulle sezioni istologiche ottenute dalle biopsie osteomidollari trattate con il metodo fino ad ora in uso all’ICP. Dopo le incubazioni in soluzione di Bouin è stato necessario un rapido risciacquo in alcool 70% per eliminare il colore giallo intenso [4]. 4.6.4 Decalcificazione La decalcificazione è stata effettuata esattamente come nella procedura attualmente in uso all’ICP. A dipendenza della durata delle incubazioni in soluzione di Bouin, la soluzione decalcificante ha assunto un leggero colorito giallo. 4.6.5 Disidratazione dei tessuti La disidratazione dei tessuti è stata effettuata esattamente come nella procedura attualmente in uso all’ICP [allegato 5]. Zampedri Jasmin 9/36
4.6.6 Taglio delle sezioni Il taglio delle sezioni di tessuto, visto il tipo di materiale, è stato effettuato da tecnici in analisi biomediche che lavorano all’istituto. Lo spessore e l’omogeneità dei tagli istologici necessari a confrontare i risultati al microscopio si ottengono solo dopo una lunga pratica ed esperienza. Il contribuito personale è comunque stato determinante, in quanto giornalmente i tecnici sono stati informati sulle esigenze del momento in merito al lavoro di diploma. 4.6.7 Colorazione delle sezioni La colorazione delle sezioni è avvenuta automaticamente per le colorazione H&E, Gomori e blu di Prussia e manualmente per la colorazione Giemsa (capitolo 4.5 Colorazioni). Le colorazioni blu di Prussia e Gomori sono state monitorate ad ogni test da un tessuto di controllo positivo; per la colorazione H&E e Giemsa non sono previsti particolari tessuti di controllo; l’osservazione al microscopio delle sezioni ha permesso di valutare l’efficacia delle colorazioni. 4.6.8 Valutazioni delle colorazioni La valutazione microscopica delle sezioni è stata di competenza dei medici patologi che sono stati informati dello studio in corso. I dati delle informazioni sono stati raccolti per mezzo di un modulo appositamente creato come descritto nel capitolo 4.7 metodo di valutazione. 4.6.9 Immagini Le immagini visibili nel capitolo 5.risultati sono state scattate per l’occasione all’ICP da un medico patologo mediante un microscopio dotato di telecamera. 4.7 METODO DI VALUTAZIONE Per la valutazione e il confronto delle colorazioni effettuate secondo le attuali procedure e di quelle in discussione è stato utilizzato un modulo appositamente creato con dei criteri di valutazione simili a quelli utilizzati da una delle organizzazione dei controlli di qualità con cui collabora l’ICP. [scheda tecnica vedi allegato 6]. Per ogni biopsia sono state distribuite le sezioni delle colorazioni H&E, Giemsa, Gomori e blu di Prussia ottenute con la procedura attuale e con utilizzo della soluzione di Bouin. Il modulo presenta un criterio numerico corrispondente ad un valore espresso in parole sulla qualità delle colorazioni in moda da rendere più facile il confronto tra le procedure. In particolare sono state valutate: Eosinofilia: Si intende la capacità delle strutture basiche, colorate con coloranti acidi, di assumere una tonalità che può variare dal rosa al rosa-arancione. Un pH ideale per una buona efficacia dell’eosina è da 4.6 a 5. [2]. Basofilia: La basofilia è la capacità delle strutture acide, colorate con coloranti basici, di assumere una tonalità che può variare dal blu al nero [2]. Contrasto: Il contrasto, ossia la chiara distinzione tra le varie strutture del tessuto, è di fondamentale importanza per poter eseguire in modo chiaro una diagnosi da parte del patologo. Artefatti: Zampedri Jasmin 10/36
Sono falsi segnali che non rispecchiano la struttura naturale e sono in genere dovuti ad errori preanalitici nel trattamento del tessuto. Gli artefatti possono diventare molto fastidiosi per il patologo impedendo l’esame microscopico delle sezioni. Valutazione globale: Valutazione generale del tessuto; rappresenta il criterio più soggettivo nel corso della valutazione . Figura 1. Modulo di valutazione consegnato ai medici patologi dell’ICP di Locarno Zampedri Jasmin 11/36
5. RISULTATI
Per una migliore visualizzazione del confronto dei risultati ottenuti sulle bom, le valutazioni
relative alla colorazione H&E con o senza incubazione in soluzione di Bouin sono state
rappresentate mediante un’istogramma.
I risultati delle altre tre colorazioni Giemsa, Gomori e blu di Prussia, necessarie per la
diagnosi delle bom, riportano il confronto tra le due metodiche in una tabella.
5.1 RISULTATI TEST 1
Nel TEST1 la durata della post-fissazione in Bouin è stata di 2 ore per un totale di quattro
biopsie osteomidollari.
Confronto colorazione H&E
5
4.5
4
3.5
punteggio
3
Metodo attuale
2.5
Bouin
2
1.5
1
0.5
0
basofilia eosinofilia contrasto artefatti valutazione
globale
Figura 2. Valutazione della colorazione H&E di quattro bom; confronto tra bom trattate
con il metodo attualmente in uso all’ICP ed altre post-fissate 2 ore in Bouin.
Commenti TEST1:
Osservando l’istogramma (figura2) è possibile concludere che dopo la post-fissazione
delle bom in soluzione di Bouin la valutazione della colorazione H&E risulta leggermente
peggiore rispetto a quella delle biopsie che non hanno subito alcuna post-fissazione.
Tutti e cinque i criteri sono stati valutati peggiori.
La basofilia della colorazione dove la biopsia ha subito una post-fissazione è molto più
intensa ed impedisce al patologo di osservare in modo dettagliato la struttura della
cromatina del nucleo delle varie cellule. Per esempio risulta difficile differenziare un
granulocita, caratterizzato da un nucleo plurisegmentato, da un linfocita, caratterizzato da
un nucleo sferico (figura 4).
L’eosinofilia è poco visibile, ovvero le strutture che vengono evidenziati con coloranti acidi,
quali il citoplasma e gli eritrociti, perdono la loro tingibilità e l’immagine assume un aspetto
omogeneo (figura 4).
Inoltre, il contrasto è meno evidente dopo una post-fissazione in soluzione di Bouin, infatti
le singole componenti cellulari si distinguono in modo meno evidente una dall’altra e con
fatica si riesce a distinguere il nucleo dal citoplasma (figura 4).
Per quanto riguarda gli artefatti, che sono dovuti principalmente ad errori preanalitici,
appare logico che questo criterio sia stato valutato peggiore dopo la post-fissazione visto
che, come descritto nel capitolo dei materiali, la parte utilizzata per il test è quella con più
materiale osseo e di conseguenza più difficoltosa al taglio e più soggetta alla formazione
di artefatti.
Zampedri Jasmin 12/36Figura 3. Colorazione H&E con la metodica attuale Figura 4. Colorazione H&E dopo 2 ore di post-fissazione
in soluzione di Bouin
Tabella 1. Valutazione colorazioni Giemsa, Gomori e
Blu di Prussia dopo 2 ore di post-fissazione in soluzione
di Bouin
Colorazione Valutazione
Giemsa uguale
Gomori uguale
Blu di prussia uguale
Le tre colorazioni eseguite sulle biopsie osteomidollari in aggiunta alla H&E ricevono
un’uguale valutazione con entrambe le metodiche. Anche la colorazioni Giemsa, molto
sensibile alle variazioni di pH, non ha subito alcun cambiamento dopo l’incubazione nella
soluzione acida, forse per la breve durata dell’incubazione.
5.2 RISULTATI TEST 2
Nel TEST2 la durata della post-fissazione in Bouin è stata di 5 ore per un totale di cinque
biopsie osteomidollari.
Confronto colorazione H&E
5
4.5
4
3.5
punteggio
3
Metodo attuale
2.5
Bouin
2
1.5
1
0.5
0
basofilia eosinofilia contrasto artefatti valutazione
globale
Figura 5. Valutazione della colorazione H&E di cinque biopsie osteomidollari; confronto
tra bom trattate con il metodo attuale in uso all’ICP ed altre post-fissate 5 ore in Bouin.
Commenti TEST2:
Osservando l’istogramma di confronto per la colorazione H&E (figura 5) è possibile
concludere che, come per la valutazione delle 2 ore di incubazione in Bouin, le sezioni
Zampedri Jasmin 13/36post-fissate in soluzione di Bouin hanno ricevuto un punteggio inferiore rispetto a quelle
trattate con il metodo attuale per tutti i cinque criteri analizzati.
La colorazione H&E dopo post-fissazione di 5 ore risulta nella sua valutazione globale
peggiore di quella con post-fissazione di 2 ore.
Figura 6. Colorazione H&E con la metodica attuale Figura 7. Colorazione H&E dopo 5 ore di post-fissazione
in soluzione di Bouin
Figura 8. Colorazione Giemsa con la metodica attuale Figura 9. Colorazione Giemsa dopo 5 ore di post-
fissazione in soluzione di Bouin
Tabella 2. Valutazione della colorazioni Giemsa, Gomori e blu di
Prussia dopo 5 ore di post-fissazione in soluzione di Bouin
Colorazione Valutazione
Giemsa peggiore
Gomori uguale
Blu di Prussia uguale
La colorazione di Giemsa sulle sezioni che hanno subito una post-fissazione di 5 ore in
soluzione di Bouin è risultata peggiore rispetto a quella con il metodo attuale. Questo è
verosimilmente dovuto alla sensibilità della colorazione alle variazioni di pH. La durata
dell’incubazione effettuata nel corso di questo test, è stata sufficientemente lunga da
alterare il risultato della colorazione: le strutture eosinofile, quali citoplasma ed eritrociti,
appaiono particolarmente sbiadite.
Per la colorazione del blu di Prussia e del Gomori, le valutazioni sono risultate equivalenti.
Zampedri Jasmin 14/365.3 PRIME DISCUSSIONI
Dopo questi primi due test di confronto tra risultati della colorazione H&E delle biopsie
osteomidollari trattate con il metodo attualmente in uso all’ICP e di quelle post-fissate in
soluzione di Bouin per 2 ore e rispettivamente 5 ore, è emerso che la valutazione globale
di queste ultime è risultata leggermente peggiore.
Per quanto riguarda le altre tre colorazioni eseguite sulle biopsie osteomidollari, è
possibile notare che per entrambe le incubazioni la valutazione delle colorazioni di Gomori
e del blu di Prussia sono risultate equivalenti, mentre per quella del Giemsa si è osservato
un risultato peggiore nel test con incubazione di 5 ore.
E’ importate osservare la disuguaglianza del materiale utilizzato nel corso dei confronti
delle valutazioni nei vari test in quanto ogni biopsia osteomidollare è stata divisa in due
pezzi per permettere il confronto dello stesso tipo di biopsia e la parte meno
rappresentativa, con molto tessuto osseo e poco tessuto ematopoietico, è sempre stata
destinata alle incubazioni in soluzione di Bouin. La maggiore presenza di tessuto osseo
non ha facilitato il taglio di queste sezioni, fattore che sicuramente ha influenzato
negativamente le valutazioni delle relative colorazioni. L’importanza del materiale per il
paziente non ha per altro consentito un altro tipo di procedura.
Visti i risultati fino a qui ottenuti, è risultato opportuno un’incontro con la Direzione per
individuare il proseguimento del lavoro di diploma.
In primo luogo, si è deciso di verificare se un’incubazione di molto maggiore a quelle
effettuate nel corso dei primi test potesse ottenere i risultati sperati; per questo motivo una
biopsia osteomidollare con abbondante tessuto ematopoiteico è così stata post-fissata per
18 ore in soluzione di Bouin (TEST3).
In secondo luogo, prendendo spunto da una tecnica di colorazione in utilizzo all’ICP, si
sono sottoposte sezioni di una biopsia ostemidollare dell’archivio ad una post-fissazione in
Bouin a 37°C solo dopo il taglio delle sezioni istologiche (TEST 4). Per la scelta della
durata dell’incubazione si è eseguito un’indagine preliminare su singole sezioni istologiche
variando il tempo di post-fissazione da 1 a 18 ore. Le relative immagini riportate di seguito
sono state valutate dalla Direzione che ha individuato la migliore.
Figura 10. Colorazione H&E con la metodica attuale Figura 11. Colorazione H&E dopo incubazione in Bouin
su vetrino di 1 ora a 37°
Zampedri Jasmin 15/36Figura 12. Colorazione H&E dopo incubazione in Bouin Figura 13. Colorazione H&E dopo incubazione in Bouin su vetrino 2 ore a 37°C su vetrino 4 ore a 37°C Figura 14. Colorazione H&E dopo incubazione in Bouin su vetrino 18 ore a 37°C Le colorazioni H&E dell’indagine preliminare relativa ai preparati istologici con fissazione in Bouin dopo il taglio mostrano un’accentuazione dell’eosinofilia ed una diminuzione graduale della basofilia con l’allungamento dei tempi di incubazione. Le differenze risultano lievi per i tempi compresi tra 2 e 4 ore, mentre per l’incubazione di 18 ore le caratteristiche istomorfologiche appaiono marcatamente alterate, in particolare con un insufficiente contrasto e conseguente difficoltà nel riconoscere le varie componenti cellulari. Delle quattro varianti è stata quindi scelta l’incubazione delle sezioni della durata di 2 ore a 37°C in Bouin per eseguire il TEST4, nel quale sono state sottoposte a questo trattamento ulteriori sedici biopsie osteomidollari. 5.4 RISULTATI TEST 3 Nel TEST3 la durata della post-fissazione in Bouin è stata di 18 ore per un totale di una biopsia osteomidollare. Zampedri Jasmin 16/36
Confronto colorazione H&E
6
5
4
punteggio
Metodo attuale
3
Bouin
2
1
0
basofilia eosinofilia contrasto artefatti valutazione
globale
Figura 15. Valutazione della colorazione H&E di una biopsia osteomidollare; confronto
tra una bom trattata con il metodo attualmente in uso all’ICP e una post-fissata per 18 ore in Bouin.
Commenti TEST3:
Osservando l’istogramma di confronto per la colorazione H&E (figura 15) è possibile
notare che la colorazione eseguita dopo una post-fissazione di 18 ore in soluzione di
Bouin è risultata molto peggiore rispetto alla colorazione eseguita con la metodica attuale.
Tutti e cinque i criteri sono stati valutati al limite della sufficienza per quel che riguarda le
biopsie post-fissate, mentre le altre hanno ottenuto risultati molto buoni.
Osservando l’immagine della colorazione H&E dopo post-fissazione di 18 ore (figura17) si
fatica a distinguere una struttura dall’altra; un medico patologo, ha aggiunto alla tabella di
valutazione il commento “zuppa”, proprio per definire l’impossibilità di distinguere i vari
elementi.
L’insufficiente basofilia rende difficoltosa la visione dei nuclei. La scarsa eosinofilia causa
un pallore dei citoplasmi ed eritrociti, che risultano difficilmente distinguibili.
Figura 16: Colorazione H&E con metodica attuale Figura 17 : Colorazione H&E dopo 18 ore di post-
fissazione in soluzione di Bouin
Zampedri Jasmin 17/36Figura 18: Colorazione Giemsa con metodica attuale Figura 19: Colorazione Giemsa dopo 18 ore di post-
fissazione in soluzione di Boun
Figura 20: Colorazione Gomori con metodo attuale Figura 21 : Colorazione Gomori dopo 18 ore di post-
fissazione in soluzione di Bouin
Tabella 3. Valutazione colorazioni Giemsa, Gomori e blu di Prussia dopo 18 ore di post-fissazione in
soluzione di Bouin
Colorazione Valutazione
Giemsa peggiore
Gomori peggiore
Blu di Prussia non valutato per assenza di ferro
Le valutazione delle colorazioni Giemsa e Gomori sono risultate peggiori; le strutture non
sono più distinguibili a causa dell’insufficiente contrasto (figura 19, 21).
Nell’immagine della colorazione Gomori (figura 21), effettuata dopo post-fissazione di 18
ore nella soluzione di Bouin, le fibre reticolari non sono più distinguibili.
La colorazione blu di Prussia non è stata valutata in quanto la biopsia utilizzata per questo
test non risultava positiva al ferro con entrambe le metodiche.
5.5 RISULTATI TEST 4
Nel corso del TEST4, le biopsie osteomidollari, fissate in formalina tamponata 4% e
processate fino al taglio delle sezioni istologiche al medesimo modo di quello attualmente
in uso, sono state incubate nella soluzione di Bouin a 37°C sottoforma di sezioni poste sui
vetrini.
Zampedri Jasmin 18/36Confronto colorazione H&E
5
4.5
4
3.5
punteggio
3
Metodo attuale
2.5
Bouin
2
1.5
1
0.5
0
basofilia eosinofilia contrasto artefatti valutazione
globale
Figura 22 . Risultati della valutazione della colorazione H&E in sedici biopsie ostemidollari; confronto tra bom trattate
con il metodo attualmente in uso all’ICP e bom tagliate e postfissate 2 ore a 37°C..
Commenti TEST 4:
La valutazione della colorazione H&E di sedici biopsie osteomidollari (figura 22) post-
fissate due ore in soluzione di Bouin a 37°C non ha messo in rilievo alcun miglioramento
dei dettagli citomorfologici. Per quanto riguardo il contrasto delle sezioni istologiche non è
stata riscontrata alcuna differenza (figura 23, 24), mentre per gli altri criteri è stato
evidenziato un lieve peggioramento. È interessante notare come le caratteristiche
istomorfologiche legate alla basofilia ed eosinofilia siano uniformemente inferiori con la
post-fissazione di 2 ore in soluzione di Bouin, mentre il contrasto delle strutture cellulari
rimanga costante. Ha invece ripercussioni maggiori il sensibile aumento degli artefatti,
risultando in una valutazione globale lievemente peggiore
Figura 23. Colorazione H&E con metodica attuale Figura 24. Colorazione H&E dopo incubazione in Bouin su
vetrino 2 ore a 37°C
Zampedri Jasmin 19/36Tabella 4. Colorazioni Giemsa, Gomori e blu di Prussia di sedici tagli di bom incubate in soluzione di Bouin 2 ore a 37°C Colorazione Valutazione Giemsa uguale Gomori uguale Blu di Prussia uguale Le valutazione delle colorazioni Giemsa e Gomori e blu di Prussia sono risultate equivalenti in entrambe le procedure. Zampedri Jasmin 20/36
6. DISCUSSIONI La colorazione H&E ha evidenziato un lieve peggioramento nella valutazione nei TEST1 e TEST2; la colorazione Giemsa è risultata invariata per il TEST1 e peggiore per il TEST2, mentre le colorazioni Gomori e blu di Prussia hanno mostrato un risultato invariato per entrambi i primi test. Vista la sensibilità alla variazione del pH della colorazione Giemsa, si può supporre cha l’incubazione di 5 ore nel TEST2 sia stata probabilmente sufficiente ad alterarne il risultato. Nel corso delle prime discussioni, è sorto il dubbio che la durata delle incubazioni fosse troppo corta e che la soluzione di Bouin non avesse il tempo di agire, nonostante la nota sensibilità della colorazione Giemsa al pH. I risultati ottenuti con i primi due test hanno mostrato solo piccole differenze, per cui si è deciso di passare direttamente ad un’incubazione molto lunga; la durata scelta si avvicinava al limite massimo d’incubazione secondo le raccomandazioni sull’utilizzo della soluzione. Il rischio del sopraggiungere di indurimenti del tessuto ha convinto a non oltrepassare questi limiti. Visto che gli effetti di un’incubazione di questa durata erano sconosciuti, una sola biopsia ostemidollare è stata inclusa nel TEST3: i risultati di questo test sono stati i peggiori in assoluto. La valutazione della colorazione Giemsa, ha confermato la sensibilità alle variazioni del pH, ottenendo risultati pessimi. La colorazione blu di Prussia non è stata valutata in quanto la biopsia non conteneva alcun deposito di ferro. Parallelamente, prendendo spunto da un’altra tecnica di colorazione utilizzata in laboratorio, si è deciso di post-fissare i tessuti a 37°C nella soluzione di Bouin dopo aver ottenute le sezioni istologiche e mantenendo il resto della procedura a monte esattamente come quella attualmente in uso. A questo proposito, singole sezioni della stessa biopsia sono state incubate nella soluzione a 37°C per tempi di diversa durata quale indagine preliminare. Dei quattro tempi analizzati, l’incubazione di 2 ore ha forniti i migliori risultati, tanto da applicare questa procedura ad un numero maggiore di biopsie. I risultati in seguito ottenuti, non hanno comunque portato ad alcun miglioramento dei dettagli citomorfologici per quel che riguarda la colorazione H&E; le altre colorazioni sono rimaste invariate. Zampedri Jasmin 21/36
7. CONCLUSIONI L’obbiettivo del lavoro di diploma è stato raggiunto malgrado la letteratura cita l’utilizzo della soluzione di Bouin come post-fissatore: lo studio, infatti, ha dimostrato che, all’istituto cantonale di patologia di Locarno, l’incubazione in soluzione di Bouin delle biopsie osteomidollari fissate primariamente in formalina tamponata 4%, non migliora i dettagli citomorfologici nelle colorazioni necessarie per la diagnosi. Le valutazioni delle colorazioni considerate nel corso dello studio, non sono migliorate in nessuna delle varianti testate; la colorazione H&E, è sempre stata valutata in modo peggiore. Le colorazioni Giemsa, Gomori e blu di Prussia , nella maggior parte dei casi non hanno presentato alcuna variazione e sporadicamente qualche peggioramento. La conclusione di questo lavoro potrebbe essere lo spunto di partenza per un futuro lavoro di diploma che potrebbe valutare l’impatto della fissazione primaria delle biopsie osteomidollari con la soluzione di Bouin. Infatti, la rivoluzione in corso del sistema di trasporto del materiale dagli ospedali del territorio all’ICP potrebbe indurre a riconsiderare questa procedura scartata inizialmente proprio per le condizioni attuali di trasporto. Zampedri Jasmin 22/36
8. RINGRAZIAMENTI
Al termine del lavoro di diploma ringrazio:
il Direttore dell’istituto cantonale di patologia di Locarno Prof. Dr. Luca Mazzucchelli
per avermi dato la possibilità di realizzare il lavoro di diploma; egli ha saputo darmi
sostegno e preziosi consigli durante tutto lo svolgimento del lavoro.
i medici patologi che hanno collaborato alla realizzazione del lavoro di diploma
valutando le sezioni istologiche nel corso dei confronti, Davide Soldini, Tiziana
Rusca, Eliana Passega-Sidler, Ulrike Perriard, Sandra Leoni, Stefano Crippa,
Gabriele Bernasconi.
Il medico in formazione Davide Soldini per l’importante sostegno nella stesura del
lavoro di diploma.
la responsabile del laboratorio di istologia Lara Lunghi-Etienne per avermi seguita
tutto questo periodo, ed avermi sostenuto nello svolgimento di questo lavoro di
diploma.
il personale di laboratorio, Daniela Tavian, Silvia Giudici, Ursula Terribilini, Michela
Pelloni, Tripun Stjanov, Stephan Zemp, Paolo Mazzatorta, Daniele Cavalli, Maura
Castellani, per la disponibilità nello svolgimento e sostegno durante tutto il periodo
di stage.
il Direttore della SSMT di Locarno Andrea Boffini per il supporto metodologico
durante tutto il periodo scolastico.
le docenti Daniela Marcacci e Sonja Marci per la disponibilità e sostegno durante i
tre anni di formazione e il periodo di svolgimento del lavoro di diploma.
infine ringrazio tutte le persone, famiglia e amici per il sostegno morale datomi
durante questo periodo.
Zampedri Jasmin 23/369. BIBLIOGRAFIA
MANUALI E DISPENSE
[9]. Bernasconi G. Colorazione di Giemsa su fissato, documenti accreditamento
ISO/IEC 17025 e ISO 15189, Istituto cantonale di patologia di Locarno, 2008
[1]. Marcacci, D. Dispense del corso blocco di istologia pratica , 26.03.2006.
LIBRI
[8]. Bio-optica, Kit per istopatologia, applicazioni e metodi,1997, p. 44, 54, 86-87
[5]. Bucher, O. Trattato di citologia e istologia . Editore Piccin Padova. 1977,
p.3-4.
[4]. Carson, F. L. Histotechnology. A self instructional text ,
Department of Pathology Baylor University, Dallas. II edition, 1996, p. 4-8, 9-10, 20
[2]. Hould René, Techniques d’histopathologie et de cytopatgologie, CCDMD, 2001, p.
52
[7]. Mazzi, V.. Manuale di tecniche istologiche e istochimiche.
Editore Piccin Padova. 1977, p. 327-332
FONTI INTERNET
[3]. http://www.pubmedcentral.nih.gov/pagerender.fcgi?artid=501666&pageindex=1,
07.12.2007
[6]. http://www.biologia.unige.it/corsi/pptlabcitoisto/microscopio101007.pdf, 21.02.2008
[10].....http://w3.uniroma1.it/anat3b/didatticanew/Tecniche%20di%20Anatomia%20Umana
%20Normale/Tecniche%20di%20Anatomia%20Umana%20Normale.htm
[11]. http://anpat.drmm.uniud.it/it/images/pdf/Fissazione.pdf
IMMAGINE COPERTINA
Immagine da documento, Dr. L. Mazzucchelli, 12.5.2008
Zampedri Jasmin 24/369. ALLEGATI 9.1 RICETTA SOLUZIONE DI BOUIN Zampedri Jasmin 25/36
Zampedri Jasmin 26/36
Zampedri Jasmin 27/36
Zampedri Jasmin 28/36
Zampedri Jasmin 29/36
9.2 DECALCIFIER MILD Zampedri Jasmin 30/36
Zampedri Jasmin 31/36
9.3 PROTOCOLLI COLORAZIONI Colorazione H&E Tabella 5. Protocollo colorazione H&E.. La durata della colorazione è di 26 minuti e 40 secondi. N° passaggio Contenuto bagno Tempo (minuti) 1 xilolo 1:00 2 alcol 100% 1:00 3 alcol 95% 1:00 4 alcol 75% 1:00 5 acqua corrente 1:00 6 ematossilina di Gill II 3:00 7 acqua corrente 5:00 8 acqua di Scott 1:00 9 acqua corrente 3:00 10 eritrosina 0.5% 6:00 11 acqua corrente 1:00 12 alcol 70% 0:30 13 alcol 95% 0:40 14 alcol 100% 1:00 15 xilolo 0:30 Tabella 6. Risultati ottenuti con la colorazione H&E Tipo di tessuto Colore nuclei blu citoplasmi rosa muscolatura rosso tessuto connettivo rosa-rosso eritrociti Rosso/arancione Colorazione blu di Prussia Tabella 7. Protocollo colorazione blu di prussia. La durata della colorazione è di 41 minuti e 30 secondi N° passaggio Bagno Tempo (minuti) 1 xilolo 1:00 2 alcol 100% 1:00 3 alcol 95% 1:00 4 alcol 75% 1:00 5 acqua corrente 1:00 6 ferro, soluzione di lavoro 20:00 7 acqua corrente 5:00 8 rosso per nuclei 5 :00 9 acqua corrente 2:00 10 alcol 70% 1:00 11 alcol 95% 1:00 12 alcol 100% 2:00 13 xilolo 0:30 Tabella 8 Risultati ottenuti con la colorazione blu di Prussia Tipo di tessuto Colore ferro+++, amianto blu nuclei rosso fondo rosa Zampedri Jasmin 32/36
Colorazione Gomori
Tabella 9. Protocollo colorazione Gomori. La durata della colorazione è di 51 minuti e 30 secondi
N° passaggio Bagno Tempo (minuti)
1 xilolo 1:00
2 alcol 100% 1:00
3 alcol 95% 1:00
4 alcol 75% 1:00
5 acqua corrente 1:00
6 permanganato di potassio 1% 10:00
7 acqua corrente 1:00
8 metabisolfito di potassio 3% 1:00
9 acqua corrente 1:00
10 alume di ferro 2% 1:00
11 acqua demineralizzata 1:00
12 nitrato d’argento: soluzione di lavoro 3:00
13 acqua demineralizzata 1:00
14 ridurre in formalina 4% non tamponata 3 :00
15 acqua corrente 1 :00
16 cloruro d’oro: soluzione di lavoro 10 :00
17 acqua corrente 1:00
18 tiosolfato di sodio 3% 1:00
19 acqua corrente 1:00
20 rosso per nuclei 5:00
21 acqua corrente 1:00
22 alcol 70% 1:00
23 alcol 95% 1:00
24 alcol 100% 2:00
25 xilolo 0:30
Tabella 10. Risultati ottenuti con la colorazione Gomori
Tipo di tessuto Colore
fibre reticolari nero
fibre collagene porpora
nuclei rosa
Colorazione Giemsa
Tabella 11. Tempi di colorazione manuale utilizzati all’Istituto cantonale di Patologia di Locarno. La durata
della colorazione è di 15 minuti e 34 secondi
N° passaggio Bagno Tempo (minuti)
1 xilolo 1:00
2 alcol 100% 1:00
3 alcol 95% 1:00
4 alcol 75% 1:00
5 acqua corrente 1:00
6 Giemsa: soluzione di lavoro 10:00 a 55°C nel micro-onde
7 soluzione di acido acetico 0:06
8 alcol 95% 0:08
9 isopropanol 0:20
10 xilolo
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