Norovirus e molluschi bivalve: dati epidemiologici e attività di ricerca
←
→
Trascrizione del contenuto della pagina
Se il tuo browser non visualizza correttamente la pagina, ti preghiamo di leggere il contenuto della pagina quaggiù
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI ‘FEDERICO II’
FACOLTÀ DI MEDICINA VETERINARIA
SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE IN
“ISPEZIONE DEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE”
Norovirus e molluschi bivalve: dati
epidemiologici e attività di ricerca
Dott.ssa Iole Ventrone
Napoli, 18 Maggio 2013
LE MALATTIE TRASMESSE DA ALIMENTI
COSTITUISCONO
UN DIFFUSISSIMO PROBLEMA
PER LA SALUTE PUBBLICA
Malattie che si manifestano in seguito all’ingestione di
alimenti che contengono agenti patogeni
Le malattie legate ad alimenti contaminati sono forse il più diffuso
problema di salute pubblica nel mondo contemporaneo ed
un’importante causa di riduzione della produttività.
Esiste un’elevata sottostima
MALATTIE TRASMESSE DA
ALIMENTI
Sintomi
vomito
solitamente
nausea
gastroenterici
diarrea
bambini
Le M.T.A. si manifestano con donne gravide
maggiore gravità nelle immunodepressi
popolazioni più sensibili
anziani
Agenti patogeni responsabili di
MTA
Esistono oggi al mondo più di 250 MTA che si
manifestano con differenti sintomi e sono
causate da diversi agenti patogeni.
•Batteri Spesso si vedono (es.: frutta ammuffita)
Oppure si vedono gli effetti della loro attività
•Muffe (es.: carni alterate)
•Virus Sono meno evidenti: siamo consapevoli
dei loro effetti quando incorriamo in una
infezione
•Parassiti
Virus trasmessi da alimenti
Gli alimenti possono rappresentare una causa di trasmissione all’uomo di patogeni
di varia natura.
II virus, differentemente dai batteri, non si moltiplicano e non producono tossine negli alimenti ma possono
essere semplicemente veicolati da questi al momento dell’ingestione.
Veicolo di patogeni
Virus enterici
Dati epidemiologici e clinici indicano una crescente importanza dei virus come
causa di malattie trasmesse con gli alimenti, il cui numero è ancora
sottostimato.
Virus enterici: infezione
Ingestione di alimenti contaminati
I virus inducono focolai di infezione
a livello di tessuti dell’intestino tenue
si replicano a livello della mucosa
intestinale
vengono eliminati con le cellule infettate nel
lume intestinale (passano attraverso il colon
con il chimo)
eliminati con le feci (108-109
virus/g)
Vomito 20-30 milioni di particelle virali
Virus enterici Appartengono a 6-8 famiglie diverse Virus che causano gastroenteriti: Rotavirus, Astrovirus, Adenovirus tipo 40 e 41 e i Calicivirus (NoV e SaV) Virus dell’epatite entericamente trasmessa: HAV e HEV Virus che si replicano nell’intestino umano, ma che causano malattia dopo essere migrati in altri organi, come il sistema nervoso centrale o il fegato: Enterovirus
Norovirus • Sono considerati una delle maggiori cause di gastroenteriti di origine non batterica • Solo negli Stati Uniti sono responsabili di 23 milioni di casi di malattia all’anno, pari a circa l’85% di tutti i casi di gastroenterite • Analoghe percentuali sono state riscontrate in Giappone e Australia dove l’impatto dei Norovirus risulta superiore a quello di qualsiasi agente di natura batterica, compresa Salmonella spp.. • In Europa sono responsabili del 40% delle gastroenteriti non batteriche di cui il 52% è riconducibile al consumo di molluschi bivalvi
Precedentemente conosciuti come “Norwalk-like virus”, dalla città
omonima nell’Ohio (USA), dove nel 1968 si ebbe il primo episodio di
infezione nell’uomoNorwalk virus
Norwalk –like virus
SRSVs
• SRSVs (Small Round Structured Viruses)
• Piccoli virus (27-35 nm)
Gastroenteritis viruses
A = Rotavirus
B = Adenovirus
C = Norovirus
D = Astrovirus
Le particelle virali sono riportate allo stesso
ingrandimento.Norovirus spp.
Famiglia Caliciviridae
– Lagovirus (Rabbit hemorrhagic disease virus, European brown hare syndrome virus)
- Vesivirus (Canine calicivirus, Feline calicivirus, Vesicular exanthema of swine virus)
- Sapovirus (Sapporo virus)
Filogenesi basata sulla proteina capsidicaNorovirus spp.: generalità
• Privi di involucro esterno
• Capside icosaedrico con depressioni superficiali a forma di calice
• Capside formato da 180 molecole (90 dimeri)
della proteina virale capsidica VP1 (55–60 kDa circa)
• Proteina capsidica organizzata in 2 dominiGenoma •Singolo filamento di RNA (ssRNA) a polarità positiva ( ~7,5 Kb) • Tipico dei virus della famiglia Caliciviridae • Genoma contiene 3 aree maggiori (ORFs) •ORF 1 (~ 1700 aa) codifica per un precursore poliproteico non strutturale poi convertito dalla viral 3C-like protease (3CL). Tale poliproteina include RdRp (regione altamente conservata usata per la diagnosi di Norovirus) •ORF 2 (~ 550 aa) codifica per la proteina maggiore del capside (VP1) •ORF 3 codifica per la proteina strutturale minore del capside (VP2) con proprietà attualmente non ancora conosciute.
La proteina VP1 forma due domini : P (protundente, P1 e P2) e S (capsidico). Il sub-dominio P2, più esterno, è il più soggetto a mutazioni e quindi responsabile dell’elevata variabilità genetica del genere Norovirus P2 contiene i siti recettoriali, quindi riconosce gli antigeni dei gruppi sanguigni e si lega ad essi.
Norovirus
• Si distinguono
geneticamente 5 genogruppi
(GI, GII, GIII, GIV e
GV), che a loro volta sono
divisi in diversi clusters o
genotipi
• GI, GII e GIV infettano
l’uomo il GIII il bovino, il
GV è stato isolato dal topo
• Il GII (il più diffuso tra i
genogruppi umani) contiene
19 genotipiGastroenterite da Norovirus: Cenni clinici
Periodo di incubazione :
•1-3 giorni
•La malattia ha decorso acuto ed è considerata
essere autolimitante
Sintomi:
• febbre, vomito, diarrea e nausea.
Sono più lievi nei bambini, a differenza delle
altre gastroenteriti virali.
•La loro risoluzione si verifica generalmente entro 2-
3 giorni.
In uno studio epidemiologico condotto in Olanda > 20%
delle persone che aveva avuto la malattia riportava
sintomi anche dopo due settimane (Rockx, 2002)Norovirus: trasmissione e
resistenza
• Trasmissione principalmente oro-fecale
• E’ descritta anche la trasmissione per via aerea, a seguito di
formazione di particelle di aerosol a partire da episodi di vomito
‘a getto’
• Oltre 30 milioni di particelle virali espulse con il vomito possono
contaminare superfici in una larga area: ci sono evidenze di una
sopravvivenza lunga di tali virus sulle superfici contaminate
• L’elevata infettività dei NoV è ulteriormente potenziata dalla
resistenza all’azione della temperatura e dei comuni
disinfettanti, rendendo estremamente difficoltosa la loro
eliminazione da superfici e alimenti contaminatiNorovirus Infettività • Elevata infettività: 10 particelle virali sufficienti a provocare la malattia • Inizialmente detta “malattia invernale da vomito” • Attualmente in aumento anche in mesi primaverili ed estivi (Regno Unito)
Diffusione dei Norovirus
• Bassa dose infettiva : consente al virus di diffondersi attraverso
aereosol, vomito, contatti interpersonali e contaminazione dell’ambiente
(livello di reinfezione del 30% o più tra contatti stretti e familiari)
• La liberazione virale precede l’esordio della malattia nel 30% circa
delle persone esposte e può continuare a lungo dopo la malattia
aumentando il rischio potenziale di una reinfezione
• Virus resistente ad un ampio spettro di temperature (dal
congelamento a 60°C), sopravvive sulle superfici ambientali, nell’acqua
delle fontane e da bere, e in numerosi cibi mangiati crudi
• Grande varietà dei norovirus e mancanza di una completa protezione
crociata e di una immunità duratura (le reinfezioni possono avvenire
per tutta la vita)
• Genoma che facilmente va incontro a mutazioni che causano
cambiamenti antigenici e ricombinazioni, che determinano l’evoluzione in
nuovi ceppi capaci di infettare soggetti sensibili.Gastroenteriti da NoV (2000-2008) I CDC (Centers for Disease Control and Prevention) americani stimano che siano almeno 23 milioni ogni anno i casi di gastroenteriti acute dovute ad infezione da Norovirus e che, nel complesso, questi agenti siano responsabili del 50% del totale delle gastroenteriti.
Gastroenteriti da NoV in UE
• The most commonly reported settings for the virus outbreaks were restaurant, café, pub, bar or hotel (39 outbreaks), but also other settings were identified, including specific communities, such as residential institutions, hospitals or home care establishments. • Several contributory factors were reported, either alone or in combination, for 59 outbreaks; among the most common were infected food handlers (33 outbreaks) and unprocessed contaminated ingredients (19 outbreaks). • Four waterborne outbreaks attributable to calicivirus (including norovirus) were also reported.
Gastroenteriti da NoV in UE
• Regno Unito: il 15,7 % di tutti di infezioni legate al consumo di vegetali e frutta
sono dovute alla contaminazione da Norovirus.
• Danimarca: (estate 2005) sono stati notificati più di 1100 casi di gastroenterite
dovuti al consumo di una fornitura di lamponi contaminati con genotipi diversi di
norovirus.
• Svezia: (giugno-agosto 2006) si sono verificati 3 episodi:
– 15 persone coinvolte dopo consumo in una festa privata di un dolce a base di
crema e lamponi. Gli esami effettuati sui campioni di feci hanno evidenziato la
presenza di Norovirus
– 10 persone si sono ammalate con sintomatologia riferibile a Norovirus dopo
consumo di un cheesecake con lamponi . La segnalazione tardiva della
tossinfezione non ha consentito il prelievo di campioni ma durante le indagini è
emerso che i lamponi utilizzati per il cheesecake erano della stessa marca di
quelli trovati nell’episodio precedente.
– 12 bambini a seguito del consumo di una bevanda a base di lamponi; 9 persone
dopo consumo di un dolce ai lamponi.Gastroenteriti da NoV in UE
2006
• Danimarca: 2 epidemie collegate ad ostriche (coinvolte 46
persone in un party), provenienza UK e Francia
• Italia: 2 epidemie collegate ad ostriche, provenienza Francia,(6
persone USSL12 Veneziana e 12 persone SIAN Trento).
• Olanda: epidemia collegata ad ostriche, provenienza Francia (3
casi)
2007
• Malta: 71 casi accertati, alimento sospetto ostriche
(provenienza Francia via Italia); presenza di GGI e GGII
2008
• Francia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Spagna
• Olanda : casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche dalla Francia
• Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K.
• Norvegia: casi di gastroenterite NoV (G1) in ostriche da U.K.Casi di GE da Norovirus in Italia • Estate 2003 – Villaggio turistico del centro Italia 183 persone coinvolte (169 ospiti e 14 impiegati) Norovirus in acqua di mare e acqua di falda non potabile (docce, piscine e servizi igienici) • Dicembre 2005 – Ristorante in provincia di Udine 184 soggetti coinvolti Antipasto di pesce contaminato da Norovirus • 2007 – Provincia di Bari Più di 1000 persone coinvolte Acqua potabile contaminata da Norovirus
Norovirus: “virus da crociera” • Novembre 2003 – Nave da crociera Aurora (P&O Cruises)
Gastroenteriti da NoV e crociere
Luglio- Novembre 2002: epidemie a bordo
di navi da crociera della stessa compagnia
Ottobre 2003: epidemia a bordo di una
nave da crociera nel Mediterraneo
Gennaio 2005: - epidemia a bordo di una nave da crociera nei Caraibi
- epidemia a bordo di una nave da crociera in Florida
Motivi
•I focolai epidemici vengono individuati e denunciati più rapidamente su una nave da
crociera che sulla terraferma.
• La vicinanza degli alloggi potrebbe accrescere le occasioni di contatto di gruppo.
• L’arrivo di altri passeggeri potrebbe causare il contagio dei passeggeri già presenti
e dei membri dell’equipaggioAlimenti coinvolti
Frutta e verdure
Molluschi bivalvi
ACQUA
CONTAMINATAFonti di contaminazione primaria di
NorovirusMolluschi e Norovirus
Diffusi su tutti i fondali
Animali scavatori sessili
Mediante meccanismo di
filtrazione si nutrono di piccole
particelle alimentari presenti
nell’acqua o nei sedimenti
Metabolismo molto attivo
Trattengono nel loro
organismo il plancton
necessario al nutrimento, ma °C Litri/ora
anche batteri e virus Mitilo 14 1,5
eventualmente presenti nelle
acque Ostrica Europea 15 12
Ostrica Americana
Molluschi bivalvi alimenti ad 20 18
alto rischio
36-432
litri/giornoNetwork europeo per la rapida individuazione delle tossinfezioni virali derivate dagli alimenti
I.S.S.
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’
• Laboratorio Nazionale di Riferimento (LNR) scelto nel
2002 dal Ministero della Salute per il controllo delle
contaminazioni virali dei molluschi bivalvi
• Collabora e diffonde le informazioni provenienti dal
Laboratorio Comunitario di Riferimento, il "Centre for
Environment, Fisheries and Aquaculture Science "
(CEFAS) - Weymouth - United KingdomReg CE 2073/2005 (1441/2007)
sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari
Criteri di sicurezza
Alimento Microrganismo Piano Limiti(2)
campionamento(1)
n c
Molluschi Salmonella 5 0 Assente in
bivalvi vivi 25g
E.coli 1 0
230MPN/100
g
(1) n= numero di unità che formano il campione
c= numero di unità campionarie i cui valori si situano tra m ed M
(2) Si applica l’ultima edizione della norma
Consideranda :
(12) Gli indicatori fecali convenzionali non sono
affidabili (…) e non è pratica sicura basarsi sulla
rimozione degli indicatori batterici fecali per determinare
i tempi di depurazione dei frutti di mare.
(23) È opportuno che i criteri per i virus patogeni nei
molluschi bivalvi vivi siano fissati quando i metodi d’analisi
sono stati sufficientemente messi a punto.
(27) Si ribadisce la necessità dello sviluppo di metodi
di analisi per virus entericiRegolamenti 853-854/2004 Classificazione delle aree di produzione/stabulazione dei molluschi bivalvi vivi Classificazione A,B e C basata sul numero di E.coli: - A
2006 :AUMENTO DEI CASI DA NOROVIRUS IN EUROPA Al programma FBVE partecipano 13 nazioni, 12 hanno risposto al quesito 9 nazioni hanno confermato un aumento della frequenza di focolai/casi rispetto allo stesso periodo del 2004 L’ Italia non ha comunicato le informazioni prima della pubblicazione dei dati. I soli 4 casi indicati suggeriscono una marcata sottostima della situazione nazionale.
Raccomandazione 20/04/2007 • La mancanza di un sistema di monitoraggio adatto a registrare tutti i casi di tossinfezioni virali ha spinto il Ministero della salute a emanare nel 2007 una raccomandazione nella quale esorta le Regioni a delegare i laboratori ufficiali per studiare metodiche standardizzate al fine di rendere più efficaci i controlli ufficiali.
• I.S.S. partecipa all’istituzione del gruppo
CEN/TC275/WG6/TAG4
“Horizontal method for detection of Norovirus and Hepatitis A
virus in food by RT-PCR”
coordinatore dr. David Lee (CEFAS)
• Necessità di definire metodi di riferimento (standardizzati ed
internazionalmente riconosciuti) per NV (GGI e GGII) e HAV:
Superfici
Frutta e vegetali
Acqua
Molluschi bivalveMetodi classici • Microscopia elettronica Scarsa sensibilità • Saggi immunoenzimatici (ELISA) Cross reattività • Colture cellulari Virus difficilmente o affatto coltivabili • Metodi molecolari METODO DI ELEZIONE
Tecniche molecolari
Basso numero di Natura complessa e non
omogenea della matrice
virus presenti alimentare
Hanno evidenziato la più alta sensibilità nell’individuare
i NorovirusProtocollo sperimentale
1. Estrazione e concentrazione del virus dalla
matrice alimentare
2. Estrazione e purificazione dell’RNA per
rimuovere gli inibenti
3. Retrotrascrizione a cDNA tramite l’enzima
trascrittasi inversa
4. Amplificazione con Real Time PCREstrazione di Boom (NucliSENS® MiniMag - bioMerieux)
Liberazione e stabilizzazione degli acidi nucleici
Legame degli acidi nucleici
Purificazione degli acidi nucleici, rimozione degli
inibitori
Recupero degli acidi nucleici in un piccolo volumeReal-Time PCR 5’VPG ORF 1 ORF 2 ORF 3 AAA3’
Real-Time PCR
Primers & Probes
NOROVIRUS GI
QNIF4 (FW): CGC TGG ATG CGN TTC CAT (Costafreda et al. 2006)
NV1LCR (REV): CCT TAG ACG CCA TCA TCA TTT AC (da Silva et al. 2007)
NVGG1p (PROBE): TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT (da Silva et al. 2007)
NOROVIRUS GII
QNIF2 (FW): ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA (Furhman et al. 2005)
COG2R (REV): TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA (De Medici et al. 2004)
QNIFS (PROBE): AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG (Furhman et al. 2005)Protocollo Real-Time PCR
• Mix RT-PCR Profilo termico:
(kit Platinum Quantitative
RT-PCR ThermoScript One- Step Temperature Number
Step System – description and time of cycles
INVITROGEN)
RT 55°C 1
1 h
2x Thermoscript reaction Preheating 95°C 1
mix 5 min
Primer 1 (12,5 μM)
95°C
Primer 2 (22,5 μM)
Amplification Denaturation 15 sec 45
Probe (6,5 μM)
ROX (50x)
ThermoScript Plus / Annealing- 60°C 1 min
Platinum Taq
extention 65°C 1 min
Acqua
RNAEstrazione acidi nucleici e PCR
• Mengovirus : controllo di processo (efficienza della procedura di
concentrazione del virus ed estrazione degli acidi nucleici)
• amplificazione del virus tal quale
• amplificazione del virus estratto dal campione
• cDNA di Norovirus : controllo interno (efficienza della reazione di
PCR)
• amplificazione di RNA di sintesi
• amplificazione dell’RNA di sintesi insieme al campioneRISULTATO
RISULTATO
Nota del
DGSAN del 24/11/2009
• L’ISS, in qualità di LRN,
ha diramato agli IZZSS
un metodo quantitativo
per la determinazione di
Norovirus e HAV in
molluschi bivalve mediante
Real Time PCR.
• Il citato metodo è stato
sottoposto a validazione
interna e risulta dotato
dei requisiti di efficaciaDisegno sperimentale
1. MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL
TIME PER L’IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN
MOLLUSCHI BIVALVE
2. RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE
RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE
CAMPANIACampionamento
15 allevamenti 46 prelievi al dettaglio
(7 area A - 8 area B)
Specie analizzate
Mytilus galloprovincialis
117 pools di 35
Mytilus galloprovincialis Ensis minor
4
Chamelea gallina
3
2 Tapes philippinarum
1
Ostrea edulis
N-O N-E
1 Glycymeris glycymeris
S-O S-E
Acquistati presso punti vendita
(19 autorizzati e 16 ambulanti abusivi)Materiali e metodi
Arrivo dei molluschi in Lavaggio per
rimuovere fango e
laboratorio detriti dalla
superficie esterna
delle valveMateriali e metodi
Selezione di 20-25 Apertura delle valve
esemplari per pool con lama pulita in
condizioni di sterilità
Dissezione del tessuto
Sminuzzamento con
digestivo con bisturi, pinzette
bisturi sterile
e forbicine steriliDisegno sperimentale
Retrotrascrizione
Fase di denaturazione
Fase di annealing
Fase di extension
Estrazione e concentrazione Retrotrascrizione a cDNA Lettura dei risultati
dell’RNA virale dalla Amplificazione con della Real Time PCR
matrice alimentare Real Time PCRRisultati – Allevamenti
Prelievi: pool delle tre profondità di ciascun filare
1ºcampionamento 2ºcampionamento 3ºcampionamento
Allevamenti Luglio 2007 / Maggio 2008 Settembre 2008 / Giugno 2009 Novembre 2009 / Marzo 2010
Zona A NO NE SO SE C NO NE SO SE C NO NE SO SE C
1 - - - - - - - - - - NC
2 - - - - - - NC - - + +
3 + + + + NC - - - - - NC
4 - - - + - NC NC
5 - - - - - - - - - NC
6 - - + - - NC NC
7 - - - - - + + + + + NC
Zona B NO NE SO SE C NO NE SO SE C NO NE SO SE C
8 + - - + + + + + + + + - + + +
9 - - - + - + + + + + NC
10 + + + + NC + +
11 + + + + NC + +
12 + + + + NC NC NC
13 NC + NC + NC + +
14 - - - - - NC + + +
15 + + + + NC + +
Positivi 13 allevamenti campionati (86,6%) in almeno uno dei prelieviRisultati – Prelievi al dettaglio
Prelievi al dettaglio Positività per NoVs
NoV GII NoV GI +
NoV GII
Campioni
negativi 35 Mytilus 27 15
27% galloprovincialis
4 Ensis minor 0 0
3 Chamelea gallina 3 2
Campioni
positivi
73% 2 Tapes philippinarum 2 1
1 Ostrea edulis 1 0
Positività in 33 dei 45
prelievi effettuati presso i 1 Glycymeris 1 1
glycymeris
punti vendita Tot campioni positivi 34 19
Il campione di Glycymeris glycymeris sequestrato
in un ristorante della provincia di Napoli
contaminato da Norovirus appartenenti
ad entrambi i genogruppi.Risultati per i punti vendita di Mytilus galloprovincialis
• Dei n. 35 punti vendita della Regione Campania nei quali sono
stati acquistati i campioni di Mytilus galloprovincialis, sono
risultati positivi :
10 dei 16 rivenditori ambulanti abusivi che vendevano il
prodotto sfuso
17 dei 19 punti vendita regolarmente registratiDisegno sperimentale
1. MESSA A PUNTO DI UN PROTOCOLLO RT-PCR REAL
TIME PER L’IDENTIFICAZIONE DI NOROVIRUS IN
MOLLUSCHI BIVALVE
2. RICERCA DI NOROVIRUS IN MOLLUSCHI BIVALVE
RACCOLTI E COMMERCIALIZZATI NELLA REGIONE
CAMPANIA
3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS
IFREMER
( Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer )
Centro di Nantes (Francia)
Sezione di Virologia (Laboratorio di Microbiologia - MIC)
Dicembre 2009 - Maggio 2010
È stata studiata l’attività
metabolica di bioaccumulo nelle
ostriche dei due più comuni
genotipi virali di Norovirus :
• NoVs GI.1
• NoVs GII.3BIOACCUMULO DI NOROVIRUS
IN CAMPIONI DI CRASSOSTEA GIGAS
• Gli esemplari di Crassostea gigas
provenivano da allevamenti siti
lungo le coste della Bretagna.
• Un grosso lotto di ostriche è stato
prelevato e posto in un’ area lungo
le coste della baia di Brest.
• Le ostriche sono state trasportate
in cassette di legno tramite
automezzi refrigerati presso i
laboratori di ricerca dell’IFREMER
di Nantes.Stoccaggio dei campioni
• I campioni sono stati stoccati in camera fredda
termostatata all’interno di vasche contenenti acqua
di mare pulita, entro 24 ore dalla raccolta.
• Temperature della camera e dell’acqua sono state
preimpostate a 9°C
• Lo stoccaggio dei campioni è durata 24 ore per
permettere ai molluschi di reidratarsi, rivitalizzarsi
e adattarsi alle nuove condizioni ambientali.
• L’acqua di mare, proveniente da cisterne interne
dell’IFREMER, era pulita e non contaminata da virus.Preparazione dei Norovirus utilizzati negli esperimenti
di bioaccumulo
• Sospensioni virali di Norovirus GI. 1 e Norovirus GII. 3
(106 virus / g di feci)
• Virus estratto da feci diarroiche provenienti da pazienti
ospedalizzati
• I campioni di feci hanno evidenziato la presenza di NoVs GI.1 e
NoVs GII.3
• Le soluzioni virali preparate per i test di bioaccumulo sono
state stoccate in frigo a 4°CEsperimenti di bioaccumulo
• No. 8 esperimenti
Il bioaccumulo dei due singoli genotipi è stato testato in 3
repliche
Il bioaccumulo del cocktail contenente i due genotipi è stato
testato in 2 repliche
• Ogni esperimento:
– durata complessiva di dieci giorni (da 0 a 9)
– utilizzo di tre vasche (A, B, C), più una quarta vasca contenente i campioni di
Crassostea gigas utilizzati come controllo negativo
– l’acqua delle vasche (300 mL per campione) e’ stata cambiata ogni 24 h con
acqua di mare pulita
– controllo quotidiano dei parametri ambientali prefissati e della vitalità degli
esemplari di Crassostea gigasBioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9)
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A B C
Giorno 0
vasca A : 32 campioni e soluzione NoVs
vasche B e C : 8 campioni rispettivamenteBioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A B C
Giorno 0
vasca A : 32 campioni e soluzione di NoVs
Vasca A :
• Aggiunta di NoVs ogni 24h
• Prelievo di 8 campioni per valutare il bioaccumulo
i giorni 1 106virus/g feci
3 3x106virus/g feci
6 6x106virus/g feci
9 9x106virus/g feciBioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A B C
Giorno 0
vasche B e C : 8 campioni rispettivamente
Vasca B :
• Aggiunta di una soluzione di NoVs 106
virus/g di feci il giorno 8 NoVs il giorno 8
• I campioni sono stati analizzati il giorno 9
dopo 24 h dall’aggiunta della soluzione virale.
• Verifica dei parametri di vitalità e attività di
filtrazione delle ostricheBioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
singoli genotipi NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A B C
Giorno 0
vasche B e C : 8 campioni rispettivamente.
Vasca C :
• Aggiunta di una soluzione di NoVs 9 x 106
virus/g di feci il giorno 8
• I campioni sono stati analizzati il giorno 9
dopo 24 h dall’aggiunta della soluzione virale
• Differenze dose-dipendenti dell’attività di
bioaccumulo di Crassostea gigas.Bioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A B C
Giorno 0
vasche A, B e C : 16 campioni rispettivamente
Vasca A :
•Aggiunta ogni 24h di cocktail di NoVs
Vasca B :
•Aggiunta ogni 24h di NoVs GI.1
Vasca C :
•Aggiunta ogni 24h di NoVs GII.3
• Vasca A analisi del bioaccumulo del cocktail virale.
• Vasche B e C controllo per evidenziare
competizione nell’attività di bioaccumulo tra i due
genotipi viraliBioaccumulo (dal giorno 0 a giorno 9):
cocktail di NoVs GI.1 e NoVs GII.3
A B C
Vasche A, B e C :
• Prelievo di 8 campioni rispettivamente i giorni:
1 106virus/g feci dopo 24 h di bioaccumulo
e
9 9x106virus/g feci dopo 9 gg di bioaccumuloEstrazione acidi nucleici
10µL mengo Eluizione dei Concentrazione
virus: dei virus:
•glycine pH 9,5 •PEG
•chloroforme- •agitation 1h; 4°C
butanol
•cat floc T
Dissezione 1,5g tessuto
del tessuto digestivo
digestivo sminuzzato
Lisi dei virus:
(Nuclisens Lysis
Buffer,
Biomérieux®)
Purificazione degli acidi
Eluizione degli nucleici
acidi nucleici (Minimag Biomérieux ®)
100 µLProtocollo Real-Time PCR
• Mix RT-PCR Profilo termico:
(kit Platinum Quantitative
RT-PCR ThermoScript One- Step Temperature Number
Step System – description and time of cycles
INVITROGEN)
RT 55°C 1
1 h
2x Thermoscript reaction Preheating 95°C 1
mix 5 min
Primer 1 (12,5 μM)
95°C
Primer 2 (22,5 μM)
Amplification Denaturation 15 sec 45
Probe (6,5 μM)
ROX (50x)
ThermoScript Plus / Annealing- 60°C 1 min
Platinum Taq
extention 65°C 1 min
Acqua
RNA3. BIOACCUMULO DI NOROVIRUS IN CRASSOSTEA GIGAS
RISULTATI
NoVs GI.1 concentrato 106/ grammo di feci
NoVs GI.1
106/g stool 10/03/2010 13/04/2010 27/04/2010
Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C
1,8x103 9,5x103
D1 8,5x103
7,5x103 9,1x103
D3 4,5x104
3,5x104 4,5x104 7,1x104
D6
6,5x104 4,5x103 3,9x104 3,5x104 5,4x104 7,7x104 9,5x104 1,0x104 2,0x105
D9
Vasca A :
I risultati nei giorni 1, 3, 6 e 9 si discostano di poco nelle tre repliche,
variando tra loro di meno di un logaritmo.
La concentrazione virale nell’arco dei nove giorni ha seguito un trend positivoRISULTATI
NoVs GII.3 concentrato 106/ grammo di feci
NoVs II.3
106/g stool 16/02/2010 10/03/2010 13/04/2010
Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C
1,3x106 1,2x104
D1 5,2x104
2,8x106 1,3x105
D3 3,3x105
3,2x106 1,4x105 6,0x105
D6
D9 9,6x106 1,1x106 1,7x107 3,4x105 2,1x105 7,0x105 4,9x105 6,1x104 8,5x105
Vasca A :
La concentrazione virale nell’arco dei nove giorni è costantemente in
crescita in tutte e tre le prove
Concentrazioni di virus più alte sono state evidenziate nella prima
prova (mese di febbraio).RISULTATI
NoVs GI.1 concentrato 106/ grammo di feci
NoVs GI.1
106/g feci 10/03/2010 13/04/2010 27/04/2010
Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C Vasca A Vasca B Vasca C
1,8x103 9,5x103 8,5x103
D1
7,5x103 9,1x103 4,5x104
D3
3,5x104 4,5x104 7,1x104
D6
6,5x104 4,5x103 3,9x104 3,5x104 5,4x104 7,7x104 9,5x104 1,0x104 2,0x105
D9
Vasca B
La capacità di filtrazione permane immodificata fino all’ultimo giorno della
sperimentazione, le condizioni ambientali erano ottimali, bioaccumulo maggiore di
quello osservato nelle ostriche in vasca A il giorno 1.
Vasca C
Le ostriche hanno bioaccumulato in 24h una quantità di virus pari o di poco
superiore a quanto evidenziato nella vasca ARISULTATI
NoVs GI.1 (106/ grammo di feci)
• Nelle stesse condizioni di
sperimentazione e a parità di
concentrazione virale, i campioni
di Crassostea gigas tendono a
bioaccumulare maggiormente
NoVs GII.3.
NoVs GII.3 (106/ grammo di feci)
• La differenza tra i risultati di
bioaccumulo è infatti di circa un
logaritmo.RISULTATI
Cocktail (NoVs GI.1 + NoVs GII.3) concentrato 106/ grammo di feci
NoVs
GI.1+GII.3
106/g stool 27/04/2010 18/05/2010
Vasca A Vasca A
Vasca B Vasca C Vasca B Vasca C
GI.1 GII.3 GI.1 GII.3
D1 1,0x104 2,5x104 8,5x103 8,1x104 1,1x104 9,5x104 5,0x103 6,4x105
D9 2,0x105 1,4x105 9,5x104 4,0x105 3,2x105 2,7x106 6,0x105 1,5x106
• Riconfermata la maggiore capacità di bioaccumulo di NoVs GII. 3 sia se
miscelato nel cocktail, sia se aggiunto singolarmente.CONCLUSIONI
• Metodica Real Time RT PCR efficace per la ricerca dei Norovirus (Nota
MinSan 24/11/2009)
• Vasta circolazione di Norovirus in molluschi bivalve raccolti e
commercializzati nella Regione Campania (57% di positività)
• Presenza di Norovirus appartenenti ai genogruppo II in tutti i campioni
positivi
• Presenza di Norovirus in allevamenti di area A
• Più del 50% di positività in campioni provenienti da punti vendita
autorizzati
• I campioni di Crassostea gigas hanno bioaccumulato una quantità di virus
costantemente in crescita
• Il genotipo GII. 3 è il patotipo del genere Norovirus più stabile nel
tessuto digestivo dei molluschi filtratori
• In compresenza di Norovirus GI. 1 e GII. 3, i campioni di Crassostea
gigas hanno bioaccumulato entrambi i genotipi virali
(non esiste immunità crociata per NoVs)Puoi anche leggere
