Immunità e vaccini anti-Covid - 31 gennaio 2021 - ACCADEMIA DI OMEOPATIA

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Immunità e vaccini anti-Covid - 31 gennaio 2021 - ACCADEMIA DI OMEOPATIA
Immunità e vaccini anti-Covid

31 gennaio 2021
Immunità e vaccini anti-Covid - 31 gennaio 2021 - ACCADEMIA DI OMEOPATIA
sommario

ØImmunità innata e immunità acquisita: attivazione dei sistemi
 di difesa naturali in presenza di un elemento patogeno
ØVirus SARS-Cov-2: caratterizzazione e proprietà
 immunologiche
ØTerapie immunologiche anti-Covid:
  ü vaccini: tipologie dei vaccini attualmente in fase di
      utilizzo e sviluppo
  ü farmaci e terapie che intervengono sul sistema
      immunitarie o sue componenti di regolazione
ØImplicazioni per un approccio naturopatico
Immunità e vaccini anti-Covid - 31 gennaio 2021 - ACCADEMIA DI OMEOPATIA
Immunità

Diversamente dai meccanismi immunitari
aspecifici, sempre pronti a rispondere
velocemente (minuti-ore) all’infezione in
maniera generalizzata, le risposte
immunitarie specifiche si sviluppano a
seguito dell’infezione e si adattano agli
specifici patogeni che invadono l’organismo,
generando una risposta altamente specifica
per le diverse macromolecole (antigeni)..

Mentre la difesa aspecifica distrugge i
patogeni e previene la diffusione
dell’infezione, confinandola localmente, i
meccanismi specifici si attivano col tempo
(alcuni giorni) ma sono molto specifici ed
efficaci. Non solo questi sono mirati alla
distruzione di antigeni specifici, ma
predispongono la memoria immunologica a
lungo termine.
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Immunità innata e immunità adattativa

                                                                                           Le risposte immunitarie aspecifiche
                                                                                           comprendono:
                                                                                           - Barriere che impediscono l’entrata
                                                                                               fisica del patogeno
                                                                                           - Recettori che riconoscono i profili
                                                                                               molecolari
                                                                                           - Citochine e complemento
                                                                                           - Cellule naturali killer (NK)
                                                                                           - Cellule dendritiche
                                                                                           - Fagociti
                                                                                           Questi diversi componenti, una volta
                                                                                           attivati, portano all’infiammazione.

                                                                                           Le citochine rilasciate durante il
                                                                                           processo    infiammatorio    inducono
                                                                                           risposte    immunitarie     specifiche:
                                                                     Recettori Toll-like   l’immunità mediata da cellule e
                            Citochine
                               Citochine
                              Enzimi
                                Enzimi                                                     l’immunità mediata da anticorpi
Recettori                   citotossici
                              citotossici
Toll-like     Interferoni                   Interferoni
                  TNF                        citochine
            interleuchine                                 Interferone I
                                                              TNF
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Immunità innata e immunità adattativa – molecole regolatrici
   Citochine: proteine/glicoproteine regolatrici sia delle risposte immunitarie aspecifiche sia specifiche, la cui attivazione è
sovrapposta e coordinata. Se prodotte in gran quantità possono fungere da ormoni (regolare tessuti e organi lontani dal luogo
   di produzione, ad.es. ipotalamo, ecc.). Altre regolano il movimento e la migrazione dei linfociti (es. dal sangue ai tessuti).
                                                          Le principali sono:
 Interferoni.
 Tipo I. Prodotti dai macrofagi e fibroblasti (regolati da Il-10). Inibiscono la replicazione virale e attivano i NK
 Tipo II. Prodotti dalle cellule T helper e T citotossiche. Stimola i macrofagi ad attaccare le cellule infette
 (attiva geni che sintetizzano composti antimicrobici nei lisosomi). SARS virus riesce a bloccare le funzioni
 degli INFs. (NB: approvati da FDA per cura di epatite B/C, verruche genitali, diverse forme di leucemia e
 cancro (sarcoma di Kaposi), sclerosi multipla
TNF (Tumor necrosis factor)
Stimola la risposta infiammatoria soprattutto in presenza di batteri Gram-negativi e in alcuni tumori. E’ prodotto
dai macrofagi e linfociti T. Nelle infiammazioni acute, viene prodotto in gran quantità con effetti diffusi e sistemici
(es. induzione della febbre, ecc.). Se il rilascio è intenso, insieme alle altre citochine, si ha una ‘tempesta di
citochine’ che può portare ad shock settico, con disfunzione del sistema immunitarie e esiti letali (NB: farmaci
antagonisti anti-TNF (es. anticorpi monoclonali) utilizzati per malattie autoimmuni, es. artrite reumatoide)
Interleuchine
Sono proteine (35) secrete dai macrofagi e linfociti, ma nche dalle cellule epiteliali. L’Il-2 stimola le cellule T
attivate a proliferare. L’Il-12 stimola le NK e cellule T a produrre l’interferone II. Hanno effetti sistemici, sulla
termoregolazione. L’eccesso di produzione è stata associata a stati patologici, es. arteriosclerosi. (NB: anticorpi
monoclonali anti-IL, es. farmaci antirigetto)
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Immunità adattativa

                                                       Le due categorie principali di cellula
                                                       della risposta immunitaria specifica
                                                       (adattativa) sono i linfociti (cellule T e
                                                       cellule B) e le cellule che presentano
                                                       l’antigene (macrofagi e cellule
                                                       dendritiche, che hanno un ruolo
                                                       importante      anche     nell’immunità
                                                       innata).

                                                       Le cellule B danno origine alla risposta
                                  Recettori TCR
Antigene Presenting Cell (APC)
                                                       immunitaria umorale, le cellule T a
MHC di classe II                                       quella cellulare.

  Citochine                                            Tutte queste cellule interagiscono
  Enzimi citotossici                                   mediante segnalazioni complesse
  interleuchine
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Immunità adattativa – I linfociti T

                                      La cellula TH (helper) attivata, si
                                      ingrandisce e si divide per mitosi    Una piccola parte delle T
                                      molte volte, formando un clone        helper clonate si
                                                                            trasformano in cellule T di
                                                                            memoria
                                           (Interleuchina-2)

                                                                            Le cellule T helper migrano
                                     Complesso
                                                                            nei tessuti infettati e
                                     antigene-MHC-II
                                                                            rilasciano citochine per
                                                                            attivare cellule T killer (Tc)
                                                                            e macrofagi.

 Come fanno le cellule Tc a riconoscere le cellule che
                 devono distruggere?                                        Le cellule Tc distruggono le
                                                                            cellule infettate
- Mediante il riconoscimento del complesso
  ‘antigene-recettore MHC-I’ sulla cellula infettata
- oppure riconoscimento del complesso ‘antigene-
  MHC-II’ sulla superficie delle APC
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Immunità adattativa – I linfociti B
  1. Una APC ingloba un virus e presenta un
  complesso antigene-MHC-II sulla superfice
                                                                                 4. Le cellule B clonate si
                                                                                 differenziano in plasmacellule
                                                                                 e, in piccole quantità, in
                             Complesso        2. Una cellula TH si lega al       cellule B di memoria
                           antigene-MHC-II    complesso e secerne
                                              citochine. Queste insieme
                                              al legame col complesso,
                                              attivano la cellula B che
                                              possiede quel complesso.
                                                                                                                  5. Le plasmacellule
                                                                                                                  rimangono nei linfonodi,
                                                                                                                  mentre gli anticorpi specifici
(Interleuchina-1)
                                                                                                                  sintetizzati, entrano nel

                                                                          2) -
                                                                                                                  circolo sanguigno e linfatico

                                                                          na
                                                                       hi
                                                                                                                  e raggiungono la zona infetta

                                                                    uc
                                                                rl e
                                                              te
                                                           (In
                                                                                                                  6. Gli anticorpi si combinano
                                                                                                                  con gli antigeni presenti sulla
                                                                                                                  superficie del patogeno e
                                                3. La cellula B attivata, si                                      inducono l’inattivazione o la
                                                ingrandisce e si divide                                           morte del patogeno
                                                per mitosi molte volte,
                                                formando un clone
Immunità e vaccini anti-Covid - 31 gennaio 2021 - ACCADEMIA DI OMEOPATIA
Immunità adattativa – Gli anticorpi

 Gli anticorpi sono proteine composte da più subunità.
          Legano in maniera specifica l’antigene

Legame tra antigene e anticorpo per neutralizzare i patogeni (video)
         https://www.youtube.com/watch?v=lrYlZJiuf18
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Immunità adattativa – Gli anticorpi
      Emivita   Forma secreta    Presenza              Funzioni                     Altro
                            Secrezioni                                 La presenza nel latte
                Monomero,                Immunità e protezione delle                                Le proteine virali S ed N inducono
                           mucose, latte                               materno permette la
IgA     6        dimero,                 mucose, attivatore del                                     una risposta immunitaria peculiare
                             materno,                                  protezione del figlio,
                 trimero                 complemento                                                rispetto ad altre infezioni di tipo
                          (sangue, poco)                               resistenti alla proteolisi
                                         Recettore per i linfociti     Sensibili alla digestione    virale, con un titolo di Ig di classe
IgD     3            -        Sangue
                                         (BCR)                         proteolitica                 IgG e IgA superiore a quelle di
                                         Difesa contro gli elminti e                                classe IgM.
IgE     2       Monomero Sangue, tessuti ipersensiblità immediata      -
                                         (reazioni allergiche)
                                         Anticorpi di legame,
                                         attivazione del               È la principale Ig del
                             Sangue,     complemento, citotossicità siero (80% ca.), sono i
IgG    23       Monomero      tessuti,   cellulare anticorpo-          soli anticorpi che
                             placenta dipendente (ADCC),               passano attraverso la
                                         immunità neonatale (fino a placenta
                                         6-12 mesi dalla nascita)
                                         Attivazione del               Sono i principali
                                         complemento, attività         anticorpi durante la
IgM     5       Pentamero     Sangue
                                         agglutinante, recettore per i prima settimana
                                         linfociti B (BCR)             d'infezione
Il complesso antigene-anticorpo
             E’ coinvolto nell’attivazione e regolazioni di molte funzioni della risposta immunitaria

Inattiva l’agente patogeno
                                                                                       Inattiva le tossine
          Aumenta la fagocitosi                                 (IgG, IgM)

                                                   Attiva il complemento

          Distrugge l’agente           Riveste la superficie            Stimola i mastociti a           Attrae i
              patogeno                 dell’agente patogeno               liberare istamina             fagociti

                                             Fagocitosi                                Infiammazione
                                             aumentata                                   aumentata
Virus SARS-Cov-2
Virus SARS-Cov-2 – struttura

                                                             I Coronavirus hanno morfologia
                                                             rotondeggiante e dimensioni di 100-150 nm
                                                             di diametro (circa 600 volte più piccolo del
                                                             diametro di un capello umano!). (Virus
                                                             influenza: 100 nm)

                                                             E’ costituito da una membrana lipidica con
                                                             glicoproteine (proteina E e M), un enzima
                                                             (esterasi HE) che circonda un filamento di
                                                             RNA stabilizzato da proteine (proteina N)

                                                             La proteina S sulla superficie permette al
                                                             virus di ancorarsi ai recettori della cellula
                                                             bersaglio

https://www.unisr.it/en/news/2020/3/viaggio-al-centro-del-virus-come-e-fatto-sars-cov-2
Virus SARS Cov-2 - genoma

                                            Il genoma consiste di una molecola singola
                                                      di RNA di ca. 30 kbasi

                                            • Codifica ca. 26 proteine
                                            • Alcune proteine hanno funzione nota,
                                              come la proteina S, N, M e E.
                                            • Tra le proteine non strutturali, l’enzima
                                              RNA polimerasi sintetizza la molecola di
                                              RNA a partire dai frammenti presenti
                                              nel citoplasma della cellula
                                            • altre proteine non hanno una funzione
                                              nota

Alcune proteine codificate e numero di
amminoacidi (aa) che le compongono
Virus SARS Cov-2 - proteina S

                                      • Tre subunità S unite compongono un trimero; i trimeri
                                        formano strutture che, nel loro insieme, somigliano a una
                                        corona che circonda il virione.
                                      • Le differenze principali di questo nuovo Coronavirus rispetto
                                        al virus della SARS sembrano essere localizzate proprio in
                                        questa proteina spike.
                                      • La glicoproteina S è quella che determina la specificità del
                                        virus per le cellule epiteliali del tratto respiratorio: è in
                                        grado di legare il recettore ACE2 (angiotensin converting
                                        enzyme 2), espresso dalle cellule dei capillari dei polmoni.
                                      • Vengono prodotti anticorpi contro diversi antigeni virali, ma
                                        soprattutto contro questa proteina, che induce sia la
                                        risposta anticorpale sia quella cellulare
                                      • Di conseguenza, quasi tutte le iniziative per controllare il
                                        virus sono ricolte verso la proteina S

Complesso recettore ACE- proteina S        https://www.nature.com/articles/nrmicro2090
Virus SARS Cov-2 – proteina S

https://www.nytimes.com/interactive/2020/health/coronavirus-unveiled.html

Proteine del virus e dinamica della spike protein
Proteina S - attivazione

                                         Ø Rappresentazione schematica del complesso proteina S-
                                           recettore ACE: il dominio (rosso) lega il recettore cellulare
                                           (verde) attraverso 6 contatti molecolari principali (*)
                     *                   Ø Un monomero della proteina S deve essere tagliato da
                         *   *       *     una proteasi specifica presente nella superficie cellulare
                                 *       Ø La scissione del legame crea un riarrangiamento della
                         *                 struttura (‘formazione del ‘gruppo di fusione’) e permette
                                           alla proteina di avvicinarsi alla membrana lipidica
                                         Ø Questo processo inizia la fusione tra le due membrane

                                                         Struttura vista dall’alto      Struttura vista di lato

RBD receptor binding domain
(azzurro), regione della proteina S
che lega la zona complementare (in
rosso) presente nell’antigene (verde)    Il gruppo di fusione della
                                             proteina S attivata
Complesso proteina S- recettore ACE II

                                                       Ø ACE-2 è il recettore presente sulla
                                                         cellula ospite
                                                       Ø Questi recettori sono
                                                         particolarmente numerosi nelle
                                                         cellule endoteliali dei vasi sanguigni
                                                         dei polmoni, dei tubuli renali e
                                                         dell’intestino
                                                       Ø E’ un enzima che idrolizza in modo
                                                         specifico alcuni peptidi, tra cui
                                                         l’angiotensina II, un potente
                                                         vasocostrittore, originando un
                                                         peptide con proprietà opposte.
                                                       Ø Il trattamento con anticorpi specifici
                                                         per il dominio dell’interazione col
                                                         recettore è in grado di ostacolare il
                                                         legame tra virus e recettore

      https://www.rndsystems.com/resources/articles/ace-2-sars-receptor-identified
Proteina S - mutanti
                          B.1.1.7 lineage (20I/501Y.V1)

       Variante        Luogo isolamento, data                Mutazioni   N° paesi
      B.1.1.7     UK, set 2020                       ORFs: 9               36
                                                     S: 9
                                                     N:2
      B.1.351     Sud Africa, ott 2020               ORF:1                 13
                                                     S: 5
                                                     N:1
                                                     E:1
      P.1         Brasile/Giappone, gen 2021         ORFs:11                2
                                                     S: 11
                                                     N:1

https://www.cdc.gov/mmwr/volumes/70/wr/mm7003e2.htm#T1_down , aggiornata al 12/1/2021
Virus SARS Cov-2 – meccanismo infettivo

                              Ø Appena entrato nella cellula, l’RNA viene
                                trascritto e tutte le proteine virali vengono
                                sintetizzate
                              Ø Alcune di queste bloccano i sistemi di
                                regolazione e difesa interni, mentre le RNA
                                polimerasi replicano l’RNA
                              Ø Tutte le proteine vengono sintetizzate in più
                                copie e assemblate
                              Ø Le proteine dell’involucro esterno formano
                                spontaneamente delle vescicole con i lipidi
                                interni della cellula
                              Ø Le vescicole catturano al loro interno una
                                molecola di RNA e fondendosi con la membra
                                cellulare vengono liberate all’esterno

                            https://www.nature.com/articles/nrmicro2090
Vaccini e immunità attiva e passiva
Immunità attiva e passiva

     Tipo di immunità                         Quando si sviluppa?             Cellule della     Durata
                                                                               memoria?       immunità?
ATTIVA
         Indotta naturalmente Dopo che gli agenti patogeni sono entrati            Si           anni
                              nell’organismo in modo naturale
     Indotta artificialmente Dopo immunizzazione con un vaccino                    Si           anni
PASSIVA
         Indotta naturalmente Passaggio degli anticorpi dalla madre al feto       No            mesi
     Indotta artificialmente Dopo somministrazione di immunoglobuline             No            mesi
Tipi di vaccini

1. Acido nucleico, vaccini a RNA/DNA

2. a. vaccino con virus intero VIVO attenuato
   b. virus intero, ma INATTIVATO (morto)

3. Vaccini con vettore virale

4. I vaccini a base di subunità proteiche (peptidi)
Vaccini in via di sviluppo
                                                Aprile 2020 (Nature)

* Qui sono inclusi:
ü i tentativi di utilizzare i vaccini già esistenti, come quelli contro la polio e la tubercolosi, per indurre una risposta immunitaria
   generalizzata (non adattativa specifica)
ü La modifica di ingegneria genetica di alcune cellule immunitarie modificate per attaccare selettivamente il virus

                                  https://www.nature.com/articles/d41586-020-01221-y
Le basi della biologia molecolare

                                    Il funzionamento di ogni
                                    cellula vivente si basa su
                                          questi principi
Dinamica delle macromolecole cellulari

Tempi di vita medi del mRNA endogeno e di alcune proteine
1. Vaccini a RNA/DNA
                        Ø I vaccini a DNA funzionano iniettando un plasmide (DNA
                          circolare, spesso di origine virale) geneticamente
                          modificato contenente la sequenza di DNA che codifica
                          l'antigene (o gli antigeni) contro cui si cerca una risposta
                          immunitaria
                        Ø Il plasmide iniettato nel corpo entra nelle cellule e il
                          DNA contenuto in esso migra nel nucleo, si fonde con
                          DNA cellulare
                        Ø Il DNA (incluso quello del plasmide) viene utilizzato per
                          formare l’mRNA messaggero che migrando nel
                          citoplasma è utilizzato per sintetizzare le proteine
                          inclusa quella antigenica
                        Ø La cellula muore e i detriti proteici vengono inglobati e
                          presentati dalla APC ai linfociti scatenando la risposta
                          immunitaria

    Ø I vaccini a RNA utilizzano l’mRNA veicolato all’interno della
      cellule mediante vescicole lipidiche
                              https://www.nature.com/articles/d41586-020-01221-y
1. Vaccini a RNA/DNA – principali attori

Ø La società tedesca BioNTech ha collaborato con Pfizer USA per sviluppare e testare un vaccino
  a mRNA contro il coronavirus noto come BNT162b2, il nome generico tozinameran o il nome
  commerciale Comirnaty
Ø ModeRNA (Massachusetts, USA), ha collaborato con il National Institutes of Health (USA) per
  sviluppare e testare un vaccino a mRNA contro il coronavirus noto come mRNA-1273.
Ø La società giapponese di biotecnologie AnGes ha lanciato un trial di fase 1 per testare un
  vaccino basato sul DNA, sviluppato in collaborazione con l'Università di Osaka e Takara Bio.
  L'azienda è passata a una sperimentazione di fase 2/3 a dicembre 2020.

Ø L’Imperial College di Londra hanno sviluppato un vaccino RNA "auto-amplificante", che per la
  la produzione continua di una proteina virale per stimolare il sistema immunitario.
Ø La Arcturus Therapeutics (California) e la Duke-NUS Medical School di Singapore hanno
  sviluppato un vaccino mRNA "auto-replicante" che porta ad una maggiore produzione di
  proteine virali

https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html
1. Vaccini a RNA/DNA

Ø I vaccini a DNA hanno vantaggi teorici rispetto ai vaccini tradizionali, compresa la capacità di indurre una gamma
  più ampia di tipi di risposta immunitaria. Diversi vaccini a DNA sono stati testati per uso veterinario. In alcuni casi,
  la protezione dalla malattia negli animali è stata ottenuta, in altri no. Nessun vaccino a DNA era stato approvato
  negli Stati Uniti per uso umano. La ricerca è in corso sull'approccio per malattie virali, batteriche e parassitarie
  negli esseri umani, così come per i tumori.
   https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_vaccine#cite_note-15

Ø Fino al 2020, l’utilizzo di vaccini a mRNA ha dato scarsi risultati in animali modello per malattie cardiovascolari,
  metaboliche e renali; e per particolari tipi di cancro e malattie rare come la sindrome di Crigler-Najjar in quanto gli
  effetti collaterali dell'inserimento di mRNA erano troppo gravi. I vaccini a mRNA per uso umano sono stati sviluppati
  e testati per le malattie quali la rabbia, da virus Zika, citomegalovirus e influenza, anche se questi vaccini a mRNA non
  sono stati autorizzati. Alcuni vaccini sono stati autorizzati per uso veterinario. Molte grandi aziende farmaceutiche
  hanno abbandonato la tecnologia per le malattie, mentre alcune biotecnologie ‘si sono rifocalizzate sull'area meno
  redditizia dei vaccini, dove le dosi sarebbero a livelli inferiori e gli effetti collaterali ridotti’.
   https://en.wikipedia.org/wiki/RNA_vaccine#cite_note-ST1-22
1. Vaccino a RNA - l’idea
1. Vaccini a RNA - processo

                                    Dall’idea alla realizzazione

https://investors.modernatx.com/static-files/5ded4992-c730-4841-b756-db53c9ab9a9b
1. Vaccini a RNA - meccanismo
         1. Nanoparticelle lipidiche
             contenenti mRNA                                              5. I linfociti T helper
                                                                         attivano i linfociti B a
                                                                          produrre anticorpi

                                                                                                                                6. Gli anticorpi anti
                       mRNA                      Subunità                                                                            proteina S
                                                 proteina S
                                                                                                                               neutralizzano il virus
2. Traduzione                                                          4a. La APC presentano i
dell’mRNA e                   3 subunità S       Proteina S completa   frammenti ai linfociti T
sintesi nuove                 si uniscono                                 helper, attivandoli
  proteine S                                          nucleo
                                    Frammenti
                                    proteina S

                                                                                                     4b. Le APC attivano
                                                                                                    i linfociti T killer che
                                                                                                     attaccano la cellula
            3. Esposizione dei frammenti                                                                   infettata
                della proteina S sulla
                 superficie cellulare
1. Vaccini a RNA – aree di miglioramento
                                                                                                                    C. Modifica mRNA
                                                                                                                    per allungarne la
                                                                                                                    vita media

                                                                                                                A. Definizione di
                                                                                                                nanoparticelle
                                                                                                                lipidiche (LNP) che
                                                                                                                permettano di
                                                                                                                preservare l’mRNA
                                                                                                                e farlo entrare
                                                                                                                nella cellula

 https://investors.modernatx.com/static-files/5ded4992-c730-4841-b756-db53c9ab9a9b   B. Purificazione mRNA per
                                                                                     diminuirne la reattogenicità
1. Vaccini a RNA – A. Definizione delle nanoparticelle lipidiche (LNP)

        Le dimensioni delle particelle influenzano l’entrata
               nei vasi linfatici e nelle cellule APC

                                                       (1 micron)

            Le LNP devono avere una dimensione ben determinata per riuscire a
             fondersi efficacemente con la membrana cellulare: ca. 80-110 nm
1. Vaccini a RNA – A. Definizione delle nanoparticelle lipidiche (LNP)
           Componenti principali

                                                                          molecole lipidiche

                                                 mRNA
                                                                       Le simulazioni indicano che la
                                                                       molecola di RNA forma diversi
                                                                       legami deboli (legami H ed
                                                                       interazioni tra i gruppi
                                                                       aromatici delle basi azotate)
                                                                       transienti con le catene dei
                                                                       componenti lipidici

I vaccini Pfizer contengono ALC-0315 (lipide cationico)   e ALC-0159 (lipide non ionico)
1. Vaccini a RNA – B. Sintesi mRNA purificato

L’enzima T7 RNA polimerasi sintetizza sia la catena completa dell’RNA sia
         frammenti di RNA più piccoli e a doppia elica (dsRNA)

                                                                     RNA polimerasi modificata via
                                                                       ingegneria genetica per
           Questi frammenti vengono riconosciuti come estranei dal     migliorarne la specificità
          sistema immunitario e scatenano una risposta immunitaria
1. Vaccini a RNA – B. Sintesi mRNA purificato

  dsRNA scatena una risposta immunitaria innata

                                        Frammenti dell’RNA sia a
                                        filamento singolo sia a
                                        doppio filamento causano
                                        una risposta immunitaria
                                        alterando la regolazione
                                        dell’espressione del DNA nel
                                        nucleo mediante delle
                                        molecole-segnale specifiche
1. Vaccini a RNA – C. Modifica chimica del mRNA
Ø La degradazione dell’mRNA inizia dalla sequenza poliA (poli adenina) presente sempre nella parte
  terminale della molecola (de-adenizzazione)
Ø Aggiungendo una timina modificata (invertita chimicamente) alla sequenza poliA finale, è stato
  possibile rendere meno facilmente degradabile l’mRNA da parte degli enzimi preposti a questa
  funzione (deadenilasi)

     In conclusione, dopo le modifiche al processo di preparazione del
         mRNA (di cui A, B e C sono le più rilevanti) è stato possibile
         prolungare la vita media dell’mRNA da 4-6 ore a 40-50 ore
1. Vaccini a RNA – vantaggi-svantaggi

vantaggi                                       svantaggi                                   vaccini già in uso
•   Forte risposta immunitaria                 • Risposta anticorpale alle volte debole:   Solo per uso
•   Induce l’attivazione dei linfociti B e T     può non rispondere alle forme mutate      veterinario
•   Sviluppo rapido                              del virus
•   Adattabilità verso nuovi mutanti           • Facilmente deperibili
•   Non sono patogenici                        • Reattogenicità componenti

                                                           https://www.nature.com/articles/nrmicro2090#Tab1
Studio clinico randomizzato vaccino Pfizer

  ü 38,000 partecipanti, di cui placebo 50%
  ü 170 persone hanno sviluppato sintomi ‘importanti’ e sono state trovate positive al
    tampone molecolare: 162 nel gruppo placebo e 8 in quello dei vaccinati
  ü Da cui l’efficacia (‘efficacy’) calcolata del 95%. (non ‘effectiveness’)*
  ü Non è stata controllata la trasmissibilità dell’infezione, ma solo la capacità del
    vaccino di prevenire i sintomi (discusso esplicitamente)
  ü Reazioni avverse ‘severe’: 0-4.6% (in funzione delle fasce d’età,
Studio clinico randomizzato vaccino Pfizer – reazioni
                         avverse

(relazione OMS gen 2021: https://www.who.int/docs/default-source/immunization/sage/2021/january/4-
evidence-assessment5-jan-2021-final.pdf?sfvrsn=cf627b70_9 )
Studio clinico randomizzato vaccino Pfizer - criticità
Osservazioni critiche del BMJ:

ü Sono stati osservati 3410 casi ‘sospetti’ ma non confermati (da test PCR), 1594 nel gruppo
  vaccinati e 1816 nel gruppo placebo: se inclusi, l’efficacia scende al 19% (NB: non riportati
  nelle pubblicazioni ufficiali dei risultati, ma presenti nei documenti elaborati dall’FDA)
ü 371 casi scartati, di cui 311 nel gruppo vaccinati per ‘importanti deviazioni dal protocollo’
ü Antidolorifici e antipiretici (e altro) sono stati utilizzati 3-4 volte più frequentemente nel
  gruppo ‘vaccinati’
ü (NB: le condizioni di doppio cieco omogenee sono state controllate nel test di Moderna da
  esperti esterni (Università, Sanità), in Pfizer solo da membri interni di staff)
ü Persone già positive escluse dai test, ma 1125 casi (3%) sono risultati comunque inclusi:
  alcuni possono essere casi di ri-infezione non controllata dal vaccino?
ü I dati grezzi non saranno disponibili prima della fine dei test (per decisione esplicita)

    https://blogs.bmj.com/bmj/2021/01/04/peter-doshi-pfizer-and-modernas-95-effective-vaccines-we-need-more-details-and-the-raw-data/
Studio clinico randomizzato vaccino Pfizer - epidemiologia

       ‘Efficacy’ vs ‘effectiveness’ negli studi clinici randomizzati dei vaccini:

       • ‘efficacy’ è il risultato del test clinico su un gruppo selezionato di persone,
       • ‘effectiveness’ è il risultato sulla popolazione reale, molto più eterogenea
Ø Solo quelli che hanno sviluppati sintomi sono stati controllati
Ø Quelli che sono stati infettati ma non hanno mostrato sintomi (asintomatici) non sono
  stati controllati, e quindi sono potenziali fonte di trasmissione
Ø Quelli che hanno sviluppato sintomi leggeri ma non sono stati controllati
Ø Lo stato di salute (malattie croniche) eterogeneo e diversificato può interferire sull’effetto
  delle vaccinazione
Ø La frazione di popolazione vaccinata (e quindi della distribuzione del vaccino) e i tempi di
  sviluppo dell’immunità da vaccino giocano un ruolo altrettanto importante dell’efficacia
             https://www.nytimes.com/2020/11/20/health/covid-vaccine-95-effective.html
2. Vaccini con virus inattivati o morti

virus inattivato o indebolito   virus morto
                                                    Ø Virus inattivato/indebolito
                                                    Il virus è indebolito attraverso vari
                                                    passaggi di infezioni su cellule umane
                                                    particolari o cellule animali fino a che
                                                    accumula una quantità tale di mutazioni
                                                    per adeguarsi alle nuove condizioni che
                                                    non lo rendono più capace di infettare le
                                                    cellule umane di partenza

                                                    Ø Virus morto
                                                    Il virus viene ucciso mediante agenti
                                                    chimici (es. formaldeide) oppure fisici
                                                    (es. calore, raggi ϒ). E’ necessario
                                                    utilizzare quantità di virus
                                                    sufficientemente grandi per sopperire
                                                    alla richiesta dei vaccini
2. Vaccini con virus inattivati o morti - meccanismo
                   virus inattivato     Β-propriolattone
                                                                         2. Il virus inattivato è                           5. Gli anticorpi
                                                                         iniettato nel corpo umano                          neutralizzano il virus
                                                                         insieme a degli adiuvanti
                                                                         (composti dell’alluminio)
                                                                         per scatenare una risposta
      virus                                                              immunitaria forte
1. Il beta-propriolattone inattiva il
virus, penetrando nell’involucro                                                            4. I linfociti T helper
virale e legandosi con l’RNA ne                                                             attivano i linfociti B per
impedisce il funzionamento. Il virus                                                        produrre anticorpi
non può più replicarsi ma le
proteine, inclusa la proteina S
rimangono intatte                                                               APC

                                                                                                                                    virus inattivato
                                                                                              Linfociti B
       3. Il virus inattivato viene     Esposizione frammenti proteici

       inglobato nelle APC, che
       frammentano le componenti
       proteiche del virus e le
       espongono sulla superficie                             Linfociti T helper                                anticorpi
2. Vaccini con virus inattivati o morti – in sviluppo

Ø Il Beijing Institute of Biological Products ha formulato un vaccino con virus inattivato chiamato BBIBP-
  CorV. E’ teastato clinicamente dalla compagnia cinese Sinopharm. Cina ha approvato il vaccino
  (01/2021). E’ usato in Bahrain e negli United Arab Emirates.

Ø La compgnia private cinese Sinovac ha sviluppato un vaccino con CoronaVax,con virus inattivato,
  dichiarando una efficacia del 78%. Studi in Brasile hanno mostrato una efficacia appena sopra il 50%

Ø La compagnia Indiana Bharat Biotech come partner del National Institute of Virology e dell’Indian Council
  of Medical Research ha sviluppato il vaccino Covaxin con virus inattivato. India ha autorizzato l’uso del
  vaccino per emergenza (03/01/2021) nonostante la mancanza di dati pubblicati dei risultati della Fase 3 che
  dimostrino che il vaccino è efficace e sicuro.

Ø Codagenix (NY) in collaborazione con il Serum Institute of India (Pune) ha utilizza il SARS-Cov-2 indebolito
2. Vaccini con virus inattivati o morti – vantaggi e svantaggi

             Vantaggi                               svantaggi                                      Vaccini già in uso
Virus        • Induce una risposta come se fosse • Non raccomandato in gravidanza e per            Morbillo, rosolia,
indebolito     una infezione naturale              persone immunocompromesse                       parotite, febbre
                                                 • Possibilità di ri-attivazione della virulenza   gialla, vaiolo, polio
                                                   del virus attenuato                             (Sabin)
                                                 • Possibili contaminazioni virali/retrovirali
                                                   dalle cellule utilizzate per la cultura di
                                                   inattivazione
                                                 • Conservanti (antibiotici)
Virus        • Induce una risposta immunitaria      • È necessaria una grande quantità di virus    Influenza, rabbia,
morto          forte                                                                               epatite A, polio
                                                                                                   (Salk)

 https://www.nature.com/articles/nrmicro2090#Tab1
3. Vaccini con vettore virale
Il vettore virale (virus del morbillo, adenovirus, ecc.) è inattivato così che non può causare la malattia ed è
geneticamente modificato per produrre le proteine del coronavirus (inserzione di geni del coronavirus)
Ci sono due tipi di virus usato come vettore: 1. il virus può ancora replicarsi entro le cellule; 2. il virus non
può riprodursi perché alcuni geni vengono inattivati              Vettore virale in grado di replicarsi, come, ad esempio,
                                                                   il virus del morbillo indebolito.
                                                                   Il vaccino contro l’Ebola appena approvato (2019), con
                                                                   adenovirus, è un esempio di vaccino a vettore virale in
                                                                   grado di replicarsi dentro le cellule. Questi vaccini
                                                                   danno una forte reazione immunitaria.

                                                                   Vettore virale non in grado di
                                                                   replicarsi.
                                                                   Nessun vaccino è stato
                                                                   approvato con questo
                                                                   metodo, ma è stato molto
                                                                   utilizzato nella terapia genica.
                                                                   Richiami saranno
                                                                   probabilmente importanti per
                                                                   una immunità a tempi lunghi
3. Vaccini con vettore virale
                                  1. DNA del coronavirus
                  RNA - DNA       all’interno del DNA del virus
                                  (adenovirus)                             5. Dopo la morte delle
                                                                       cellule, si ha l’esposizione dei
                                                                       frammenti della proteina S da
    coronavirus
                                                                               parte delle APC

                                  2. Virus entra
                                  nella cellula

                                                                                                 Linfociti T            Linfociti B
                                                                                                   attivati               attivati
3. La vescicola                                                                                       6. Le cellule APC attivano i
interagisce con la                                                                                 linfociti T citotossici e T helper
membrana nucleare e il                                     4. mRNA esce dal nucleo e              che a loro volta attivano i linfociti
DNA passa nel nucleo                                       viene trascritto per produrre la          B per la risposta anticorpale
                                                           proteina S
3. Vaccini con vettore virale – in sviluppo
Ø University of Oxford e AstraZeneca usano l’adenovirus degli chimpanzee. Il nome
  del vaccino è ChAdOx1 nCoV-19 o AZD1222.
Ø Johnson & Johnson sta preparando un vaccino con un adenovirus (ad26) col
  nome JNJ-78436735 or Ad26.COV2.S.
Ø Gamaleya Research Institute e il Russia’s Ministry of Health, hanno sviluppato
  il vaccino Sputnik V Gam-Covid-Vac.

Ø La compagnia cinese CanSino Biologics ha sviluppato il vaccino dal nome
  Convidecia insieme all’Institute of Biology presso l’Academy of Military Medical
  Sciences cinese. Il vaccino utilizza l’adenovirus Ad5.
3. Vaccini con vettore virale – test clinici

     Test clinico randomizzato dell’AstraZeneca (2020)

     Ø Test clinici randomizzati con 40.000 persone
     Ø Su un sottogruppo di 9000 persone, ci sono stati 27 casi nel gruppo
       vaccinati e 71 nel gruppo placebo (vaccinati con un vaccino con
       meningococco attenuato), 62% efficacia con due dosi di vaccino a
       distanza di 28 g.
     Ø Un sottogruppo è stato vaccinato per sbaglio con una dose intera
       seguita da un richiamo con mezza dose: efficacia 90%
     Ø Reazioni severe acute: ca. 1%
     Ø E’ stata studiata la prevenzione dell’insorgenza dei sintomi e non la
       trasmissione
https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(20)32661-1/fulltext )
3. Vaccini con vettore virale – vantaggi/svantaggi

                 Vantaggi                          svantaggi                                   Vaccini già in uso
Virus replicante • Sviluppo rapido                 • Esposizione pregressa allo stesso virus (o Ebola
o non replicante • Induce immunità anticorpale e     simile) può ridurre la risposta
                   attiva linfociti T                immunitaria
                                                   • Possibilità di ADE

                                                            https://www.nature.com/articles/nrmicro2090#Tab1
3. Vaccini con vettore virale – ADE

ADE dall’inglese Antibody-Dependent Enhancement, “intensificazione
[dell’infezione] anticorpo-mediata. E’ stato osservato con altri
coronavirus (SARS-Cov-I), il virus Zika, HIV e febbre gialla e in modelli
animali.
Se alcuni degli anticorpi (non neutralizzanti) prodotti non si legano
abbastanza bene al virus – o non sono presenti nella giusta
concentrazione – possono aumentare l’infezione tramite ADE.
Nell'ADE, i virus rivestiti di anticorpi ottengono un ingresso tramite i
recettori anticorpali sui macrofagi e sulle altre cellule fagocitarie
(APC): il virus viene inglobato nella cellula ma non viene degradato.
Il virus sopravvive e inizia a moltiplicarsi distruggendo alla fine la
APC. Questo processo può innescare una risposta infiammatoria
pericolosa, inclusa la ‘tempesta di citochine’.

Si è osservato dopo i vaccini, quando c’è stata l’esposizione al virus
naturale
https://www.lescienze.it/news/2020/06/01/news/sviluppatori_vaccini_covid-19_anticorpi_non_pericolosi-4737233/
https://www.med4.care/ade-antibody-dependent-enhancement/
4. Vaccini con peptidi

Tramite il vaccino vengono iniettati direttamente nel corpo
alcune proteine (o parti di esse) del coronavirus,
soprattutto quelle dell’involucro esterno

                                                              Quasi tutti i vaccini di questo tipo (ca. 28)
                                                              in via di sviluppo utilizzano la proteina S o
                                                              alcune sue parti, tra cui la regione di
                                                              interazione col recettore cellulare
                                                              (‘receptor binding domain’, RBD). Vaccini
                                                              simili contro la SARS sono stati testati
                                                              positivamente nelle scimmie, ma non
                                                              sono stati testati con le persone.
4. Vaccini con peptidi - meccanismo

                               DNA virale

  1. Si sintetizza una
  copia di DNA dall’RNA                                    4. Le nanoparticelle
  del virus, che viene                                     vengono inglobate
                                                                                              5. I linfociti T helper
  incorporata nel DNA                                      dalle APC che
                                                                                              attivano i linfociti B per la
  del baculovirus                                          attivano i linfociti T
                                                                                              produzione di anticorpi
                                                           helper

 2. Il baculovirus entra
 nella cellula di farfalla
 e iL DNA tradotto
 produce proteine S

QS-21, saponina dall’albero
   del legno di Panana

                                            3. La proteine vengono estratte dalle cellule e    6. Le APC attivano i
                                            inglobate in nanoparticelle formate da             linfociti T killer
                                            tensioattivi particolari e vengono iniettate
4. Vaccini con peptidi – vaccini in via di sviluppo

Ø Il Vector Institute, centro di ricerca in biologia in Russia, ha registrato un vaccino chiamato
  EpiVacCorona. Il vaccino contiene piccolo porzioni di protein virali (peptidi). Approvato nell’ottobre
  2020. Nel gennaio 2021 Putin ha iniziato una campagna di vaccinazione di massa con questo
  vaccino e con il vaccino Sputnik V

Ø Novavax (Maryland, USA) ha sviluppato un vaccino che utilizza peptide chiamato NVX-CoV2373.
  Il vaccino produce un livello molto alto di anticorpi. La fase 3 della sperimentazione è iniziata a
  dicembre 2020
4. Vaccini con peptidi – vantaggi/svantaggi
                   Vantaggi                               svantaggi                                           Vaccini già in uso
 Proteina S        • Può avere meno effetti               • ha bisogno di adiuvanti                           Influenza, HPV
 intera              collaterali rispetto al virus        • alcuni richiami sono necessari
                     intero (rossore o gonfiore nel       • risposta immunitaria alterata che può
                     sito di iniezione)                     provocare gravi lesioni al fegato e causare ADE
                   • induce una buona risposta
                     immunitaria e attiva i linfociti T
 Proteina S        • buona risposta anticorpale e         • solo risposta anticorpale, necessita di
 ricombinante        immunità protettiva                    numerosi richiami e l’uso di adiuvanti
 RBD*              • Buona risposta anticorpale e         • ND
                     attivazione cellule T
 RBD               • Più sicuro di altri vaccini a RBD; • ripetizione delle dosi
 recombinante        induce alto titolo di anticorpi    • adiuvanti
                     neutralizzanti e attivazione
                     cellule T
 peptidi           • Facilmente preparabili               • Poco immunogenici
                   • Velocemente formulabili              • costosi
* RBD: Receptor Binding Domain: dominio di legame del recettore        https://www.nature.com/articles/nrmicro2090#Tab1
Conclusioni

Ø I vaccini in via di sviluppo e di utilizzo sono diversi fra di loro

Ø I vaccini utilizzano meccanismi diversi per stimolare la risposta
  immunitaria

Ø Le reazioni avverse possono avere diverse manifestazioni

Ø I vaccini possono essere impiegati per la stimolazione del sistema
  immunitario sia per la prevenzione delle infezioni sia per
  trattamento delle malattie
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