IL MICROSCOPIO: apparecchiatura capace di ridurre il limite di risoluzione dell occhio - people@unipi

IL MICROSCOPIO:
•apparecchiatura capace di ridurre il limite di risoluzione dell occhio
umano (distanza minima di due punti percepiti come separati tra di loro)
•a seconda della radiazione utilizzata per esplorare il preparato si
possono avere:
    •microscopio ottico: utilizza la luce visibile; è il microscopio ottico
    in senso stretto
    •microscopio a fluorescenza, a raggi ultravioletti, a raggi infrarossi;
    utilizzano radiazioni non visibili
    •microscopio elettronico: utilizza elettroni accelerati

Unità di misura in microscopia

• Micron (µ)     = 1mm/1000
• Nanometro (nM) = 1 µ/1000
• Angstron (A )  = 1nM/10

Il microscopio ottico
• Consta di :
    • Stativo
    • Lenti (oculare e obiettivo)
    • Apparato di illuminazione

Il microscopio ottico
• Lo stativo si compone:
  – Piede
  – Tavolino
  – Supporto per oculare/i
  – Supporto per obiettivi
  – Vite macro/micrometrica

Obiettivi
• Dalla combinazione delle lenti degli obiettivi e degli
  oculari dipende l effetto ottico del microscopio
• L obiettivo è la parte del microscopio che si trova più
  vicino all’oggetto da esaminare
• Alla estremità dell obiettivo si trova la lente frontale
  (l obiettivo tanto più ingrandisce quanto più piccolo è il
  diametro della lente frontale)
• Si dice distanza frontale di un obiettivo la distanza che
  intercorre, quando il microscopio è a fuoco, fra la lente
  frontale e la superficie inferiore del vetrino coprioggetto
  (spessore 0,16 mm)
• La distanza frontale è tanto minore quanto più forte è
  l obiettivo (ottimale >ingrandimenti con distanza > per
  avere gioco per messa a fuoco)

Obiettivi
•   Apertura numerica: funzione che esprime la massima
    quantità di luce che un obiettivo è capace di accettare e
    condurre alla formazione dell’immagine
         – A.N. = n.sena
           n = indice di rifrazione del mezzo interposto tra
              lente frontale e coprioggetto (aria 1, acqua 1,33,
              olio imm. 1,53)
           a = metà dell’angolo (di apertura) del cono dei
              raggi che emanano da un punto qualsiasi
              dell’oggetto esaminato e che sono utilmente
              accettati dalla lente frontale
•   supponendo che l angolo sia 180 , il seno della metà
    angolo è = 1
•   il valore dell A.N. coinciderà con n (aria 1, acqua 1,33
    olio imm. 1,53)

Obiettivi
• Potere di risoluzione: proprietà di un
  obiettivo di mettere in risalto maggiori o
  minori dettagli in rapporto all apertura
  numerica
• Potere di risoluzione =__l___
                            2 A.N.
        l= lunghezza d onda della luce
  In luce bianca il potere di risoluzione è di circa
    0,2 µm

Tipi di obiettivi
• Obiettivi a secco
• Obiettivi a immersione (permettono di inserire
  sostanze* tra lente frontale e vetrino
  coprioggetto)
       * olio di legno di cedro
• Altre tipologie basate su correzioni cromatiche o
  di curvatura:
  –   acromatici (giallo-verde)
  –   semiapocromatici (blu-rosso)
  –   apocromatici (violetto-rosso)
  –   a campo piano o planari (correggono curvatura di
      campo ->immagine piana)

Oculari
• Ingrandiscono l immagine data
  dall’obiettivo proiettata sul loro piano

• Possono essere di diversi tipi:
  – A lente frontale regolabile
  – da proiezione
  – fotometrici ecc.

Apparato di illuminazione
• Sorgente luminosa
• Diaframma di campo
• Condensatore: sistema di lenti che
  convoglia sul piano del preparato i
  raggi luminosi
• Diaframma ad iride o di apertura, serve a
  regolare la luce proiettata sul preparato

ingrandimento
• L ingrandimento del microscopio è dato dal
  prodotto
   ingrandimento dell’obiettivo X ingrandimento dell oculare
• Per misurare la grandezza degli oggetti
  esaminati si usa un micrometro oculare

Tipi di microscopio
•   Stereomicroscopio
•   Microscopio in campo chiaro
•   Microscopio in campo scuro
•   Microscopio rovesciato
•   Microscopio a contrasto di fase
•   Microscopio interferenziale
•   Microscopio a luce polarizzata

•   Microscopio a fluorescenza
•   Microscopio a luce ultravioletta

•   Microscopio elettronico a trasmissione
•   Microscopio elettronico a scansione
•   Microscopio elettronico ad alto voltaggio
•   Microscopio a forza atomica
•   Microscopio confocale Laser

Microscopio a fluorescenza
• Utilizza radiazioni u.v. con lunghezza d’onda di
  circa 365 nm (u.v. lungo)
• Rivela fini strutture che assorbono le radiazioni
  u.v. ed emettono luce visibile
• Tipi di fluorescenza:
   – Fluorescenza primaria: mette in evidenza sostanze
     autofluorescenti (vitamina A, porfirina, riboflavine,
     elastina, clorofilla)
   – Fluorescenza secondaria: evidenzia strutture dopo
     che sono stati impiegati fluorocromi (acridina,
     fluoresceina, rodamina come tali o legati ad altre
     sostanze come ad esempio agli anticorpi)

Microscopio a luce ultravioletta
• Utilizza radiazioni u.v. di circa 254-257 nm
  di lunghezza d’onda (u.v. corto)
• Mette in evidenza fini strutture che
  assorbono le radiazioni u.v. e come
  conseguenza danno immagine negativa
• Evidenzia le strutture costituite da acidi
  nucleici (DNA, RNA)

Microscopio confocale laser
• La luce emessa dai fluorocromi presenti nel campione
  viene catturata dalle lenti dell'obbiettivo e deviata da uno
  specchio dicroico (linea nera diagonale) su un
  fotomoltiplicatore, che trasforma l'intensità luminosa
  rilevata in un segnale elettrico di intensità proporzionale.
• Tra lo specchio dicroico e il fotomoltiplicatore, il fascio
  luminoso attraversa un diaframma (o pinhole), che
  impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori fuoco
  (che, seppure in minima parte vengono illuminate per
  effetto di fenomeni di rifrazione all'interno del campione)
  di raggiungere il fotomoltiplicatore.
• In questo modo solo il segnale luminoso relativo dal
  piano di fuoco viene registrato e utilizzato nella
  formazione dell'immagine finale.

• il segnale elettrico in uscita dal
  fotomoltiplicatore viene quindi digitalizzato e
  inviato ad un computer che registra i valori di
  intensità misurati per ogni punto.
• Questi valori vengono utilizzati per ricostruire
  l'immagine a video: ogni punto del campione
  verrà a corrispondere ad un pixel dello
  schermo,
• L'accostamento di tutti i singoli pixel
  corrispondenti ai punti scanditi dal fascio laser
  nel campione darà così l'immagina finale.

• Spostando lungo l'asse verticale il campione
  dopo ogni scansione, è possibile eseguire
  serie di scansioni successive corrispondenti a
  piani focali via via più profondi all'interno del
  campione.
• Queste scansioni prendono il nome di sezioni
  ottiche e la loro sovrapposizione ordinata,
  eseguita via software, consente di ricostruire
  un'immagine complessiva dell'intero volume
  scandito, in cui tutti i piani sono
  contemporaneamente a fuoco.