PLATELIA Candida Ag Plus 62784
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PLATELIA™ Candida Ag Plus 96 62784 RILEVAZIONE DELL’ANTIGENE MANNANO DI CANDIDA NEL SIERO O PLASMA UMANO MEDIANTE METODO IMMUNOENZIMATICO
1- FINALITÀ DEL TEST
Platelia™ Candida Ag Plus è una tecnica immunoenzimatica tipo sandwich in
micropiastra per la rilevazione dell’antigene mannano di Candida nel siero o
plasma umano.
2- INDICAZIONI PER L’USO
La diagnosi di candidosi invasiva deve essere basata sulla ricerca di anticorpi
abbinata alla ricerca di antigeni circolanti. 13
Platelia™ Candida Ag Plus (codice 62784) è un test che, utilizzato
unitamente a Platelia™ Candida Ab Plus (codice 62785), contribuisce a
migliorare la precocità e la sensibilità di tale diagnosi nell’ambito di una
procedura diagnostica completa integrante i fattori di rischio intrinseci e
iatrogeni e i dati clinici e micologici 10, 13, 14. Rientra inoltre nella logica di un
sistema di sorveglianza bioclinica dei pazienti come aiuto alla decisione
terapeutica. 8
3- INTERESSE CLINICO
Le infezioni da Candida sono le più frequenti infezioni fungine nosocomiali
e le candidemie rappresentano la quarta causa di setticemie di origine
nosocomiale. 12, 15, 16
Sul piano clinico, le candidosi invasive rappresentano le infezioni più
gravi con un tasso di mortalità che oscilla tra il 30 e il 70% nei pazienti
immunodepressi. La formulazione della diagnosi rimane difficile a causa della
bassa specificità dei sintomi clinici e della ridotta sensibilità delle tecniche
di emocoltura. Nella maggior parte dei casi è un insieme di valutazioni che
consente di sospettare una candidosi invasiva e di approntare una terapia
idonea 2. In questo contesto, la diagnosi delle candidosi sistemiche deve
necessariamente associare le tecniche sierologiche ai metodi micologici
diretti. La ricerca di antigeni in circolo nel siero o plasma sembra essere
un modo per migliorare questa diagnosi nei pazienti a rischio di candidosi
invasiva 10, 13, 14. I principali rischi includono la neutropenia successiva a
chemioterapia o trattamento immunosoppressivo (cancerologia,
oncoematologia, trapianto) 4, 10, l’antibioticoterapia ad ampio spettro, la
presenza di cateteri venosi, la nutrizione parenterale, la dialisi renale,
l’impianto di protesi (rianimazione medica e chirurgica). 5, 13, 16
Tra gli antigeni della Candida, il mannano è un polisaccaride legato in modo
non covalente alla parete cellulare e rappresenta oltre il 7% del peso secco
di C. albicans. Tale antigene sembra costituire uno dei principali marcatori
delle candidosi invasive.
Un follow-up regolare dei pazienti a rischio, che abbini la rilevazione
dell’antigene mannano e degli anticorpi anti-mannano, costituisce un aiuto
alla diagnosi delle candidosi invasive. 9, 10, 13
924- PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
Platelia™ Candida Ag Plus è una tecnica immunoenzimatica tipo sandwich,
realizzata in una fase, su micropiastra, che consente la rilevazione
dell’antigene mannano di Candida circolante nel siero o plasma umano.
L’anticorpo monoclonale (Acm) di topo, EBCA-1, diretto contro le a 1-5
oligomannosidi di Candida, caratterizzato nel corso di lavori precedenti 13, 14,
viene utilizzato per:
• Sensibilizzare i pozzetti della micropiastra e legarsi all’antigene mannano,
• Rilevare l’antigene legato alla micropiastra sensibilizzata (coniugato: Acm
marcato con perossidasi).
I campioni di siero o plasma vengono trattati con il calore in presenza di
EDTA per dissociare i complessi immuni e precipitare le proteine sieriche
che potrebbero eventualmente interferire con la reazione immunoenzimatica.
I campioni di siero o plasma trattati e il coniugato vengono distribuiti nei
pozzetti della micropiastra sensibilizzati con l’anticorpo monoclonale anti-
mannano.
Dopo l’incubazione a 37°C, le strip vengono lavate per rimuovere tutto ciò
che non viene legato. In presenza di mannano circolante nel campione
umano, si forma un complesso: Ac anti-mannano – mannano - Ac anti-
mannano/ perossidasi.
L’aggiunta di cromogeno contenente il substrato della perossidasi e incubato
a temperatura ambiente permette lo sviluppo dei complessi eventualmente
formati.
La reazione enzimatica viene bloccata attraverso l’aggiunta di acido
solforico 1N.
La lettura della densità ottica viene effettuata con uno spettrofotometro
impostato su 450/620nm.
5- REAGENTI
Le quantità di reagenti fornite sono state calcolate per consentire
l’esecuzione di 96 test in un massimo di 9 cicli.
Per informazioni sulle condizioni di conservazione e sulla data di scadenza
dei reagenti, consultare le indicazioni riportate sulla confezione.
Prima dell’uso, consentire a tutti i reagenti di raggiungere la temperatura
ambiente (+18-30°C). Subito dopo l’uso, riportare tutti i reagenti a +2-8°C.
Riporre le strip non utilizzate nell’involucro originario e richiudere con cura.
Non rimuovere l’essiccante.
93Componente Contenuto Quantità
Micropiastra:
- 96 pozzetti (12 strip da 8 pozzetti ciascuna)
R1 Microplate 1
sensibilizzati con l’anticorpo monoclonale anti-
mannano EBCA-1.
Soluzione di lavaggio concentrata (20 x):
Concentrated
- Tampone Tris-NaCl (pH 7,4)
R2 Washing 1 x 70 ml
- 2 %Tween® 20
Solution (20x)
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Calibratore 0 pg/ml (pronto per l’uso):
- Tampone Tris-NaCl-Trealosio, non contenente
R3 Calibrator 0 mannano purificato da Candida albicans 1 x 2,0 ml
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Calibratore 62,5 pg/ml (pronto per l’uso):
- Tampone Tris-NaCl-Trealosio
R4a Calibrator 62.5 1 x 2,0 ml
- Mannano purificato da Candida albicans
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Calibratore 125 pg/ml (pronto per l’uso):
- Tampone Tris-NaCl-Trealosio
R4b Calibrator 125 1 x 2,0 ml
- Mannano purificato da Candida albicans
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Calibratore 250 pg/ml (pronto per l’uso):
- Tampone Tris-NaCl-Trealosio
R4c Calibrator 250 1 x 2,0 ml
- Mannano purificato da Candida albicans
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Calibratore 500 pg/ml (pronto per l’uso):
- Tampone Tris-NaCl-Trealosio
R4d Calibrator 500 1 x 2,0 ml
- Mannano purificato da Candida albicans
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Controllo negativo:
Negative
R0 - Siero umano negativo per il mannano 2 x 1,5 ml
Control
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Controllo positivo:
Positive
R5 - Siero umano contenente mannano 2 x 1,5 ml
Control
- Conservante: < 1,5% ProClin™ 300
Coniugato (pronto per l’uso):
- Anticorpo monoclonale anti-Mannano, marcato
R6 Conjugate con perossidasi 1 x 17 ml
- Porpora bromocresolo
- Conservante:Componente Contenuto Quantità
Soluzione TMB cromogeno (pronta per l’uso):
Chromogen
R9 - Soluzione di 3,3’,5,5’ - tetrametilbenzidina 1 x 28 ml
TMB
(< 0,1%), H2O2 (10. Se il liquido contaminante è un acido, pulire o neutralizzare le superfici con
bicarbonato di sodio, quindi risciacquare e asciugare la zona; nel caso in
cui il liquido contaminante contenga materiale biologicamente pericoloso,
lavare la zona con un disinfettante chimico.
11. Eliminare tutti i campioni e i reagenti utilizzati per il test come materiale
potenzialmente infettivo. L’eliminazione dei rifiuti chimici e biologici
pericolosi deve essere effettuata conformemente alle normative in vigore.
12. ATTENZIONE: Di seguito è riportato un elenco dei potenziali rischi chimici
presentati da alcuni componenti del kit (fare riferimento al capitolo 5 -
REAGENTI)
AVVERTENZA: Alcuni reagenti contengono ProClin™ 300 < 1,5%
Per i rischi e le raccomandazioni di sicurezza consultare la tabella alla
fine dell’inserto della confezione.
13. Su richiesta è disponibile la scheda dei dati di sicurezza.
7- PRECAUZIONI PER L’USO
1. I CAMPIONI DI SIERO O PLASMA CONGELATI E CONSERVATI IN
CONDIZIONI IGNOTE POSSONO FORNIRE FALSI RISULTATI POSITIVI
DOVUTI ALLA CONTAMINAZIONE DA PARTE DI FUNGHI E/O BATTERI.
2. Non utilizzare il kit o uno dei reagenti dopo la data di scadenza.
3. Non mischiare, né combinare reagenti provenienti da kit con numeri di
lotto diversi in uno stesso ciclo.
OSSERVAZIONE: per la soluzione di lavaggio (R2, identificativo* 20x
color verde), il Cromogeno (R9, identificativo* TMB color turchese) e
la soluzione bloccante (R10, identificativo* 1N color rosso) è possibile
utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, a condizione che i
reagenti siano strettamente equivalenti e venga utilizzato un unico
lotto in uno stesso ciclo di analisi.
OSSERVAZIONE: la soluzione di lavaggio (R2 identificativo* 20X color
verde) non può essere mischiata con la soluzione di lavaggio (R2
identificativo* 10X color blu) fornita nei kit reagenti Bio-Rad.
* sull’etichetta del flacone
4. Prima dell’uso, attendere 30 minuti per consentire ai reagenti di
raggiungere la temperatura ambiente (+18-30°C).
5. Utilizzare preferibilmente materiale monouso oppure elementi in vetro
perfettamente lavati e risciacquati con acqua distillata.
6. Verificare l’accuratezza delle pipette e il corretto funzionamento delle altre
strumentazioni.
7. Ricostituire con cura il reagente R2, evitando qualsiasi contaminazione.
968. La reazione enzimatica è particolarmente sensibile al metallo o agli ioni
metallici. Di conseguenza, evitare che gli elementi di metallo entrino
in contatto con le varie soluzioni contenenti il coniugato o la soluzione
substrato.
9. Durante il pipettamento dei calibratori, dei controlli e dei campioni,
utilizzare sempre un nuovo recipiente per distribuire il siero al fine di
evitare qualsiasi contaminazione.
10. Per garantire un lavaggio adeguato dei pozzetti, eseguire il numero di
cicli di lavaggio raccomandato e assicurarsi che tutti i pozzetti, una
volta riempiti, vengano completamente svuotati. Il lavaggio deve essere
eseguito con un sistema di lavaggio per micropiastre.
11. Non fare asciugare la micropiastra nell’intervallo di tempo compreso tra la
fine del ciclo di lavaggio e l’aggiunta dei reagenti.
12. Non utilizzare lo stesso contenitore per il coniugato e la soluzione di
sviluppo.
13. Evitare di esporre la soluzione di cromogeno o la soluzione di sviluppo
ad una luce intensa durante lo stoccaggio o l’incubazione. Evitare che
le soluzioni contenenti il cromogeno entrino in contatto con un agente
ossidante.
14. Il Cromogeno (R9) deve essere incolore. La colorazione blu indica che il
reagente non può essere utilizzato, pertanto dovrà essere sostituito.
15. Evitare che la soluzione bloccante entri in contatto con agenti ossidanti,
metallo o ioni metallici.
16. Non reintrodurre nel flacone originario il coniugato in eccesso non
distribuito.
8- PREPARAZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI
Micropiastra (R1)
Ogni vassoio contenente 12 strip è confezionato in una bustina. Con un paio
di forbici, tagliare la bustina al di sotto della saldatura. Aprire la bustina ed
estrarre il vassoio. Riporre il vassoio contenente le strip non utilizzate nella
bustina originaria. Richiudere con cura la bustina e conservarla a +2-8°C.
Dopo l’apertura della bustina sotto vuoto, le strip mantengono la stabilità fino
a 8 settimane se conservate a +2-8°C nella bustina originaria, richiusa con
cura. Verificare la presenza di essiccante.
Soluzione di lavaggio (R2)
Diluire in rapporto 1:20 la soluzione di lavaggio concentrata in acqua
distillata: 50 ml di R2 in 950 ml di acqua distillata. (Prevedere 400ml di
soluzione di lavaggio diluita per una piastra completa da 12 strip al di fuori
del volume morto dovuto alla strumentazione utilizzata).
97Dopo la diluizione, la soluzione di lavaggio può essere conservata per 14
giorni a +2-30°C.
Dopo l’apertura, la soluzione di lavaggio concentrata conservata a +2-30°C,
in assenza di contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza
indicata sull’etichetta.
Calibratore 0 (R3), Calibratore 62,5 (R4a), Calibratore 125 (R4b),
Calibratore 250 (R4c), Calibratore 500 (R4d):
I calibratori sono pronti per l’uso.
Dopo l’apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a
+2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.
Controllo Negativo (R0), Controllo Positivo (R5):
Il controllo negativo (R0) e il controllo positivo devono essere trattati con la
soluzione acida di EDTA (R7) come i campioni dei pazienti per fungere anche
da prova del trattamento.
Dopo l’apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a
+2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.
Coniugato (R6), Soluzione di trattamento dei campioni (R7),
Soluzione TMB cromogeno (R9):
Questi reagenti sono pronti per l’uso.
Dopo l’apertura e in assenza di contaminazione, i reagenti conservati a
+2-8°C mantengono la stabilità fino a 8 settimane.
Soluzione bloccante (R10):
Questo reagente è pronto per l’uso.
Dopo l’apertura, questo reagente conservato a +2-8°C, in assenza di
contaminazione, mantiene la stabilità fino alla data di scadenza indicata
sull’etichetta.
9- CAMPIONI
1. I test vengono eseguiti su campioni di siero o plasma raccolto su
anticoagulante di tipo EDTA, eparina o citrato.
2. Per il prelievo, il trattamento e la conservazione dei campioni ematici,
attenersi alle seguenti raccomandazioni:
• Prelevare un campione di sangue secondo le precauzioni in uso.
• Per il siero, consentire la completa coagulazione dei campioni prima di
procedere alla centrifugazione.
• Conservare le provette chiuse.
• Dopo la centrifugazione, estrarre il siero o il plasma e conservarlo in una
provetta chiusa.
• I campioni possono essere conservati a +2-8°C a condizione che il test
venga eseguito entro 5 giorni.
98• Se il test non viene eseguito entro 5 giorni, congelare i campioni ad una
temperatura di -20°C (o -80°C).
• Si raccomanda di non procedere a più di cinque cicli di congelamento
/ scongelamento. I campioni devono essere accuratamente miscelati
(Vortex) dopo lo scongelamento e prima del test.
3. I campioni contenenti 60 g/l di albumina umana o 120 g/l di proteine
totali oppure 200 mg/l di bilirubina non coniugata o 200 mg/l di bilirubina
coniugata, i campioni lipemici contenenti l’equivalente di 30 g/l di trioleina
(trigliceride) o 5 g/l di colesterolo o i campioni sottoposti ad emolisi
contenenti 2 g/l di emoglobina non influenzano i risultati.
4. Non riscaldare i campioni.
10- PROCEDURA
Materiale fornito
Vedere il capitolo REAGENTI
Materiale richiesto ma non fornito
1. Acqua distillata o demineralizzata sterile, per la diluizione della soluzione di
lavaggio concentrata.
2. Carta assorbente.
3. Guanti monouso.
4. Occhiali di protezione.
5. Ipocloruro di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio.
6. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o
preimpostate per misurare e dispensare da 10 µl a 1000 µl e 1 ml, 2 ml e
10 ml.
7. Provette per microcentrifuga in polipropilene da 1,5 ml con tappi a
tenuta ermetica, in grado di tollerare una temperatura di 120°C (blocco
riscaldante) o 100°C (bagnomaria bollente)
• Provette con tappo a vite: provette coniche da 1,5 ml, Bio-Rad rif. 224-
0010 o equivalente.
OPPURE
• Provette con cappuccio di chiusura: EZ Micro Test Tubes, 1,5 ml,
Bio-Rad rif. 223-9480 o equivalente.
8. Dispositivi di bloccaggio (VWR rif. 6054001 o equivalente). Questi
dispositivi chiudono ermeticamente le provette con cappuccio di chiusura
e impediscono qualsiasi apertura accidentale durante le variazioni di
temperatura o di pressione. Una piccola impugnatura permette di togliere
la microprovetta dal blocco riscaldante o dal bagnomaria evitando
qualsiasi rischio di ustioni.
9. Centrifuga da banco da laboratorio per provette in polipropilene da 1,5 ml
in grado di raggiungere 10.000g.
9910. Durante l’utilizzo di un blocco riscaldante per il trattamento dei sieri:
• Blocco riscaldante. Si raccomandano i seguenti modelli di blocco
riscaldante:
- modello con 1 blocco: Grant rif. QBD1 (VWR rif. 460-0074)
- modello con 2 blocchi: Grant rif. QBD2 (VWR rif. 460-0076)
• Blocco per blocco riscaldante: i due blocchi riscaldanti (QBD1,QBD2)
devono essere utilizzati con il blocco Grant rif. QB-E1 (VWR rif. 460-
8517).
Durante l’utilizzo di un bagnomaria bollente per il trattamento dei sieri:
• Supporto galleggiante per provette da microcentrifuga
• Bagnomaria bollente con regolazione termostatica impostata su 100°C.
11. Cilindri graduati con capacità di 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml.
12. Contenitore per rifiuti contaminati.
13. Agitatore tipo «Vortex».
14. Incubatore di micropiastre con regolazione termostatica impostata su
37°C ± 1°C (*).
15. Sistema di lavaggio semi-automatico o automatico per micropiastre(*).
16. Lettore di micropiastre dotato di filtri 450 e 620 nm(*).
(*) Per informazioni dettagliate sulla strumentazione raccomandata, consultare
il nostro reparto tecnico.
Trattamento dei campioni
Il trattamento del controllo negativo (R0) e del controllo positivo (R5) deve
essere effettuato contempo-raneamente al trattamento di tutti i campioni
dei pazienti mediante l’aggiunta di 100 µL di soluzione di trattamento R7. I
calibratori R3, R4a, R4b, R4c e R4d, che sono pronti per l’uso, non devono
essere sottoposti a questo trattamento.
1. Distribuire 300 µl di ogni campione da analizzare del controllo negativo
(R0) e del controllo positivo (R5) in provette in polipropilene da 1,5 ml.
2. Aggiungere in ogni provetta 100 µl di soluzione di trattamento dei sieri
(R7).
3. Omogeneizzare vigorosamente vortexando Chiudere ermeticamente la
provetta per mezzo di un dispositivo di bloccaggio al fine di prevenirne
l’apertura accidentale durante il riscaldamento. Non forare il tappo.
4. Blocco riscaldante:
Collocare le provette in un blocco riscaldante a 120°C per 6 minuti. Le
provette devono essere collocate nel blocco solamente al raggiungimento
della temperatura indicata.(*)
OPPURE
100Bagnomaria:
In caso di utilizzo di un bagnomaria: riscaldare le provette per 3 minuti a
100°C.(*)
5. Togliere con cura le provette calde dal blocco riscaldante o dal
bagnomaria e collocarle in una centrifuga. Centrifugare le provette a
10.000 g per 10 minuti.
6. Il supernatante viene utilizzato per la rilevazione dell’antigene mannano.
Analizzare i supernatanti attenendosi alla seguente procedura. Il test deve
essere eseguito entro le due ore successive al trattamento del siero o del
plasma.
(*) La stretta osservanza dei valori relativi alla durata e alla temperatura,
così come l’utilizzo del materiale raccomandato, sono fattori essenziali per
la riuscita del test. È opportuno non fare affidamento sulla temperatura
visualizzata dalla strumentazione, ma verificare che la temperatura sia
conforme alle specifiche utilizzando una sonda termica che verrà introdotto
in una provetta contenente olio minerale: devono essere raggiunti 120°C
all’interno della provetta nel blocco riscaldante e 100°C all’interno della
provetta nel bagnomaria bollente.
NB :
• Tutti i campioni trattati secondo questa procedura possono essere
utilizzati per il test Platelia™ Aspergillus EIA, poiché le procedure di
trattamento dei campioni sono identiche per questi due test.
• Non conservare i campioni (controllo negativo, controllo positivo e
campioni) dopo il trattamento.
Procedura EIA
Attenersi strettamente al protocollo proposto.
Rispettare le buone prassi di laboratorio:
• Prima dell’uso, attendere almeno 30 minuti per consentire ai reagenti di
raggiungere la temperatura ambiente (18-30°C).
• Ad ogni dosaggio, utilizzare tutti i calibratori e i controlli per convalidare i
risultati del test.
Procedere nel modo seguente:
1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione dei
calibratori, dei controlli e dei campioni, secondo lo schema seguente:
- A1: Controllo positivo R5 (supernatante del controllo trattato)
- B1: Calibratore 500 pg/ml (R4d)
- C1: Calibratore 250 pg/ml (R4c)
- D1: Calibratore 125 pg/ml (R4b)
- E1: Calibratore 62,5 pg/ml (R4a)
- F1: Calibratore 0 pg/ml (R3)
- G1: Controllo negativo R0 (supernatante del controllo trattato)
1011 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R5 S2 S10
B R4d S3 S11
C R4c S4
D R4b S5
E R4a S6
F R3 S7
G R0 S8
H S1 S9
2. Estrarre il vassoio e le strip (R1) dall’involucro protettivo. Riporre le strip
non utilizzate nell’involucro originario e richiudere con cura l’involucro.
3. Distribuire nei pozzetti corrispondenti 100 µl di supernatante del campione,
del controllo negativo (R0) e del controllo positivo (R5) trattati.
4. Distribuire quindi 100 µl di R4d, R4c, R4b, R4a e R3 secondo lo schema
della piastra.
NB: A questo stadio della manipolazione può essere controllata la
distribuzione della gamma di calibrazione. Infatti, la gamma presenta
una tonalità di colore che va dall’arancio (R4d) al giallo chiaro (R3).
5. Omogeneizzare il contenuto del flacone R6 capovolgendolo prima
dell’uso. Se si prevede di utilizzare una pipetta multicanale, prelevare solo
il volume necessario alla realizzazione del ciclo: utilizzare 2,5 ml per due
strip da 8 pozzetti.
6. Distribuire in ogni pozzetto 100 µl di soluzione di coniugato (R6).
7. Ricoprire la micropiastra con la pellicola adesiva premendo
adeguatamente su tutta la superficie per assicurarne la tenuta.
8. Incubare immediatamente la micropiastra in un incubatore a secco di
micropiastre per 90 ± 10 minuti a 37°C (± 1°C).
9. Preparare la soluzione di lavaggio diluita (fare riferimento al capitolo 8).
10. Togliere la pellicola adesiva. Aspirare il contenuto di ogni pozzetto in
un contenitore per rifiuti contaminati (contenente ipocloruro di sodio).
Lavare la micropiastra 5 volte mediante un sistema di lavaggio per
micropiastre (con 800 µl di soluzione di lavaggio diluita). Al termine
dell’ultimo lavaggio, capovolgere la micropiastra e picchiettare
delicatamente sulla carta assorbente per rimuovere il liquido in
eccesso.
11. Distribuire rapidamente in ogni pozzetto e al riparo dalla luce 200 µl di
soluzione di cromogeno TMB (R9).
10212. Incubare la micropiastra al buio a +19-25°C per 30 ± 5 minuti. Non
utilizzare la pellicola adesiva durante questa fase di incubazione.
13. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante (R10) in ogni pozzetto,
osservando la stessa sequenza e lo stesso ritmo di distribuzione utilizzati
per l’aggiunta della soluzione di sviluppo. Miscelare adeguatamente.
14. Asciugare accuratamente il fondo di ogni piastra.
15. Leggere la densità ottica di ogni pozzetto a 450 nm (filtro di riferimento a
620 nm) entro i 30 minuti successivi all’aggiunta della soluzione bloccante
(le strip devono sempre essere conservate al riparo dalla luce prima della
lettura).
16. Prima della trascrizione dei risultati, verificare la corrispondenza fra la
lettura e il piano di distribuzione delle piastre.
11- CONTROLLO DI QUALITÀ (CRITERI DI VALIDITÀ)
Utilizzare i calibratori e i controlli su ogni micropiastra per ciascun saggio.
Per la convalida del test, è necessario soddisfare i seguenti criteri:
• Valori della densità ottica:
DO R4a > 0,280
DO R0 < DO R4a
• Rapporti:
DO R4a / DO R3 > 1,25
DO R4b / DO R4a > 1,15
DO R4c / DO R4b > 1,15
DO R4d / DO R4c > 1,20
• Concentrazione di mannano nel controllo positivo R5:
La concentrazione di R5 deve essere pari alla concentrazione indicata sul
flacone ± 30%.
12- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Tracciato della curva di calibrazione
La curva di calibrazione viene realizzata con i 5 punti gamma (calibratori) 0
pg/ml, 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml e 500 pg/ml.
Tracciare la curva di calibrazione [DO = funzione (pg/ml)] riportando sull’asse
verticale (asse delle Y) le DO dei calibratori R3, R4a, R4b, R4c e R4d, e
riportando sull’asse orizzontale (asse delle X) la rispettiva concentrazione di
pg/ml.
Optare per un tracciato punto per punto che colleghi i vari punti gamma.
103 eterminazione della concentrazione di mannano (pg/ml) dei
D
campioni analizzati
Dalla curva precedentemente tracciata, è possibile determinare, per ogni
campione analizzato, la concentrazione di mannano, espressa in pg/ml.
Interpretazione dei risultati
• I campioni con concentrazioni inferiori a 62,5 pg/ml (C < 62,5) vengono
considerati «negativi» per la presenza dell’ antigene mannano.
• I campioni con concentrazioni comprese tra 62,5 e 125 pg/ml (62,5 ≤ C
< 125) vengono considerati «intermedi» per la presenza dell’ antigene
mannano.
• I campioni con concentrazioni pari o superiori a 125 pg/ml (C ≥ 125)
vengono considerati «positivi» per la presenza dell’ antigene mannano.
• I calibratori utilizzati per il tracciato della curva di calibrazione non
permettono una titolazione delle concentrazioni superiori a 500 pg/ml.
Per conoscere in modo più preciso la concentrazione dei sieri fortemente
positivi, sarà opportuno ripetere il test dopo la prediluizione in rapporto
1:5 del supernatante del campione trattato (nuovo trattamento) con
la soluzione di lavaggio (R2) diluita (fare riferimento al capitolo 8) . La
concentrazione così ottenuta dovrà essere moltiplicata per un fattore 5.
I risultati «intermedi» potranno essere confermati con un nuovo campione
prelevato dal paziente nelle settimane successive alla data del prelievo
che ha fornito una concentrazione intermedia.
13- LIMITI DI UTILIZZO
1. Un test negativo non può escludere la diagnosi di candidosi invasiva in
quanto i risultati potrebbero essere determinati da una concentrazione
estremamente ridotta dell’antigene nel corso dell’infezione e dalla rapida
eliminazione del mannano.
La diagnosi di candidosi invasiva può essere stabilita solo dopo avere
confrontato tutti gli aspetti clinici, terapeutici, radiologici, citologici,
micologici diretti e sierologici, interpretando con oculatezza ogni elemento
a sè stante.
2. La negatività dell’antigenemia deve inoltre essere confrontata con il
risultato della ricerca degli anticorpi anti-mannano: anche in caso di
candidosi invasiva, l’antigene è più difficilmente rilevabile nei pazienti
positivi alla ricerca di anticorpi anti-mannano (fare riferimento al paragrafo
15- Efficacia).
3. L’efficacia della rilevazione del mannano nel siero o plasma è correlata alla
frequenza dei test realizzati sui pazienti. Al fine di migliorare la sensibilità e
la precocità della positività del test, è auspicabile un follow-up regolare dei
pazienti a rischio, così come la ricerca di anticorpi anti-mannano.
1044. Attenersi alla procedura e all’interpretazione dei risultati descritte per il
test Platelia™ Candida Ag Plus quando i campioni vengono analizzati
per la presenza dell’antigene mannano. Si consiglia all’utente del kit di
leggere attentamente il manuale prima di procedere alla realizzazione del
test. In particolare, attenersi scrupolosamente al protocollo indicato per il
pipettamento dei campioni e dei reagenti, il lavaggio della micropiastra e la
durata delle fasi di incubazione.
5. Un risultato falsamente negativo potrà essere ottenuto qualora
i campioni e i reagenti non vengano aggiunti secondo la procedura
indicata nel manuale. In caso di sospetta candidosi invasiva o di
errore di procedura, dovrà essere analizzato un nuovo campione del
medesimo paziente.
6. I pozzetti contenenti campioni di pazienti negativi possono essere
contaminati da pozzetti contenenti il controllo positivo, i calibratori o
i campioni di pazienti qualora il contenuto di un pozzetto entri
accidentalmente in contatto con un altro a causa di una maldestra
manipolazione della micropiastra o di un’errata tecnica di pipettamento
durante l’aggiunta dei reagenti.
7. L’efficacia di Platelia™ Candida Ag Plus non è stata valutata con campioni
di siero o plasma provenienti da neonati o pazienti pediatrici.
8. L’efficacia di Platelia™ Candida Ag Plus non è stata stabilita per una
lettura manuale e/o una determinazione visiva dei risultati.
9. Nel corso di uno studio esterno, è stata osservata una reazione crociata
nei pazienti sottoposti a perfusione con determinati lotti di liquidi di
riempimento, composti da idrossietilamido (tipo Hestéril 6%), utilizzati nel
trattamento delle insufficienze circolatorie: ipovolemia, shock emorragico,
shock settico.
10. Sono stati osservati risultati falsamente positivi quando i campioni
contenevano un tasso di gammaglobuline umane ≥ 60 g/l nonché con
alcuni campioni analizzati e risultati positivi alla ricerca di anticorpi anti-
Toxoplasma.
14- VALORI ATTESI
La prevalenza dell’antigene mannano specifico di Candida misurata
mediante il test Platelia™ Candida Ag Plus è stata valutata su un pannello
di 613 campioni provenienti da 51 pazienti olandesi (Sito 1 – Paesi Bassi)
ospedalizzati per il trattamento di un tumore (emopatia maligna per 49
pazienti e tumore non ematologico per 2 pazienti) mediante chemioterapia
intensiva.
105Su 613 campioni, 88 sono risultati positivi e 51 intermedi, pari ad una
prevalenza di 88/613 = 14,4% [IC 95%: 11,7-17,4%] considerando negativi
i risultati intermedi e 139/613 = 22,7% [IC 95%: 19,4-26,2%] considerando
positivi i risultati intermedi. In termini di pazienti, su 51 analizzati, 23 hanno
presentato almeno un campione positivo e 14 hanno presentato almeno un
campione intermedio e nessuno positivo, pari ad una prevalenza di 23/51
= 45,1% [IC 95%: 31,1-59,7%] considerando negativi i risultati intermedi
e 37/51 = 72,6% [IC 95%: 58,3-84,1%] considerando positivi i risultati
intermedi.
Su questi 51 pazienti, 30 (388 campioni) non presentano alcuna candidosi
invasiva documentata. Tra questi, 20 sono colonizzati da lieviti (12 da
Candida albicans, 7 da Candida albicans associato ad un’altra specie di
Candida e 1 colonizzato da almeno una specie di Candida non albicans).
Quattro di questi pazienti presentano sintomi clinici e un’infezione
superficiale da Candida dimostrata microbiologicamente.
In 24 di questi pazienti sono presenti gravi danni delle barriere mucose. Sui
388 campioni corrispondenti, 41 sono risultati positivi e 43 intermedi, pari
ad una prevalenza di 41/388 = 10,6% [IC 95%: 7,7-14,1%] considerando
negativi i risultati intermedi e 84/388 = 21,7% [IC 95%: 17,7-26,1%]
considerando positivi i risultati intermedi. In termini di pazienti, su 30
analizzati, 10 hanno presentato almeno un campione positivo e 11 hanno
presentato almeno un campione intermedio e nessuno positivo, pari ad una
prevalenza di 10/30 = 33,3% [IC 95%: 17,3-52,8%] considerando negativi
i risultati intermedi e 21/30 = 70,0% [IC 95%: 50,6-85,3%] considerando
positivi i risultati intermedi.
15- EFFICACIA
A. Studi di riproducibilità
• Precisione intra-saggio (ripetibilità):
Al fine di valutare la ripetibilità intra-saggio, i cinque campioni positivi
(due negativi e tre positivi) sono stati analizzati 32 volte durante lo stesso
ciclo. Per ciascun campione è stata determinata la concentrazione di pg/
ml. La tabella riportata di seguito fornisce la media delle concentrazioni, la
deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione (%CV) per ciascun
campione:
106Precisione intra-saggio (ripetibilità)
Campione Campione Campione Campione Campione
N=32 negativo fortemente debolmente mediamente fortemente
negativo positivo positivo positivo
Media delle
concentrazioni 25,1 54,8 63,7 154,1 261,8
(pg/ml)
DS 4,11 5,20 4,27 8,01 16,93
% CV 16,3% 9,5% 6,7% 5,2% 6,5%
• Precisione inter-saggio (riproducibilità):
Al fine di valutare la riproducibilità inter-saggio, i cinque campioni (due
negativi e tre positivi) sono stati analizzati in duplicato, in due cicli al giorno,
per un periodo totale di 20 giorni. Per ciascun campione è stata determinata
la concentrazione di pg/ml. La tabella riportata di seguito fornisce la media
delle concentrazioni, la deviazione standard (DS) e il coefficiente di variazione
(%CV) per ciascun campione:
Precisione inter-saggio (riproducibilità)
Campione Campione Campione Campione Campione
N=80 negativo fortemente debolmente mediamente fortemente
negativo positivo positivo positivo
Media delle
concentrazioni 24,1 55,0 70,0 161,6 264,9
(pg/ml)
DS 6,99 11,47 14,50 30,07 38,62
% CV 29,0% 20,8% 20,7% 18,6% 14,6%
107B. Reattività crociata
Numero di campioni
Patologia Positivi Intermedi
analizzati
Aspergillus 10 0 1
Anticorpi anti-ds-ADN 10 0 0
ANA positivi 10 0 0
IgG e IgM Mieloma 20 0 1
IgG anti-Toxoplasma 10 3 1
Anticorpi umani
10 0 0
anti-topo
Fattore reumatoide 10 0 0
C. Linearità
Il range di linearità del test Platelia™ Candida Ag Plus è stato stabilito tra 20
e 470 pg /ml sulla base di studi su diluizioni condotti su 4 campioni positivi.
D. Studi clinici
L’efficacia del kit Platelia™ Candida Ag Plus è stata valutata in 3 siti con un
totale di 852 campioni provenienti da 505 pazienti.
SENSIBILITÀ
La sensibilità del kit Platelia™ Candida Ag Plus è stata determinata su un
pannello di 436 campioni provenienti da 89 pazienti ospedalizzati in 2 siti
situati nei Paesi Bassi e in Francia. La ripartizione dei campioni è la seguente:
• Sito 1 (Paesi Bassi): 225 campioni provenienti da 21 pazienti olandesi
ammessi in un reparto di oncoematologia per il trattamento di un’emopatia
maligna (19 casi) o di un tumore non ematologico (2 casi) mediante
chemioterapia intensiva, seguita, a seconda dei casi, da un innesto di
cellule staminali ematopoietiche. Tutti questi pazienti hanno presentato
una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla base di
almeno una coltura positiva a Candida (emocoltura o coltura di prelievo
tissulare normalmente sterile). 17
• Sito 2 (Francia): 211 campioni provenienti da 68 pazienti francesi
ospedalizzati in vari reparti di rianimazione o di oncoematologia e aventi
una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla base di
almeno una emocoltura positiva a Candida spp.
NB: I pannelli di campioni utilizzati nel corso di questi due studi provengono
da pazienti i cui campioni sanguigni sono stati prelevati tra il 1999 e il 2007.
La stabilità relativa dell’antigene mannano e dell’anticorpo anti-mannano
in questi campioni durante il periodo di congelamento, nonché al termine
108di ogni ciclo di congelamento e scongelamento, rende i risultati presentati
dipendenti dalle condizioni di conservazione del pannello analizzato. I valori
di sensibilità del test determinati nell’ambito di studi clinici retrospettivi
possono quindi essere inferiori a quelli ottenuti nel corso di studi clinici
prospettici, realizzati su campioni prelevati in tempi più recenti.
Risultati del Sito 1
I 21 pazienti olandesi inclusi in questo studio sono stati ammessi in ospedale
per il trattamento di un’emopatia maligna (leucemia mieloblastica acuta,
leucemia linfoblastica acuta, leucemia linfoide cronica, mieloma, sindrome
mielodisplasica, anemia aplasica o linfoma non Hodgkin) o di un tumore non
ematologico mediante chemioterapia intensiva seguita eventualmente da
un innesto di cellule staminali ematopoietiche 17. Questi 21 pazienti hanno
sviluppato una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla
base di almeno una coltura positiva a Candida spp. (emocoltura o coltura
di prelievo tissulare normalmente sterile). Lo stato di questi pazienti, per la
presenza dell’antigene mannano specifico di Candida, rilevato con il test
Platelia™ Candida Ag Plus, viene considerato positivo se almeno uno dei
campioni del paziente è positivo. In assenza di campione positivo, lo stato
viene considerato intermedio se almeno uno dei campioni del paziente è
intermedio e negativo quando tutti i campioni del paziente sono negativi. 17
Risultati con Platelia™ Candida Ag Plus
Categorie di pazienti Numero di pazienti Sensibilità Sensibilità
(numero di campioni) (intermedi (intermedi
considerati considerati
21 pazienti (225 campioni) Positivo Intermedio Negativo negativi) positivi)
presentanti almeno una coltura
61,9 % 76,2 %
positiva a Candida spp. 13 (47) 3 (8) 5 (170) 95% IC [38,4-81,9%] 95% IC [52,8-91,8%]
Parallelamente al test Platelia™ Candida Ag Plus, questi stessi campioni
sono stati analizzati per la presenza di anticorpi anti-mannano con il
kit Platelia™ Candida Ab Plus 9. Lo stato del paziente per la presenza
dell’antigene mannano o di anticorpi anti-mannano specifici di Candida viene
considerato positivo se almeno uno dei due test è positivo. In assenza di test
positivo, lo stato viene considerato intermedio se almeno uno dei due test è
intermedio e negativo quando entrambi i test sono negativi.
Combinazione dei risultati con Platelia™ Candida Ag Plus e
Platelia™ Candida Ab Plus
Categorie di pazienti
Numero di pazienti Sensibilità Sensibilità
(numero di campioni) (intermedi (intermedi
considerati considerati
21 pazienti (225 campioni) Positivo Intermedio Negativo negativi) positivi)
presentanti almeno una coltura
71,4 % 90,5 %
positiva a Candida spp. 15 (98) 4 (34) 2 (93) 95% IC [47,8-88,7%] 95% IC [69,6-98,8%]
109Risultati del Sito 2
I 68 pazienti francesi inclusi in questo studio sono stati ammessi in
vari reparti di rianimazione (chirurgia, trapianto, ustioni, traumatologia,
pneumologia, ecc.) o di oncoematologia (emopatia maligna). Tutti hanno
sviluppato una candidosi invasiva microbiologicamente dimostrata sulla
base di almeno un’emocoltura positiva a Candida (albicans, parapsilosis,
norvegensis, glabrata, krusei o tropicalis) 6, 7, 14 nei giorni precedenti o
successivi il prelievo sanguigno studiato. I campioni di sangue sono stati
prelevati in media 6 giorni dopo la prima emocoltura positiva a Candida
(minimo 61 giorni prima, massimo 67 giorni dopo). Lo stato di questi pazienti
per la presenza dell’antigene mannano specifico di Candida, rilevato con il
test Platelia™ Candida Ag Plus, viene considerato positivo se almeno uno
dei campioni del paziente è positivo. In assenza di campione positivo, lo
stato viene considerato intermedio se almeno uno dei campioni del paziente
è intermedio e negativo se tutti i campioni del paziente sono negativi.
Risultati con Platelia™ Candida Ag Plus
Numero di pazienti Sensibilità Sensibilità
Categorie di pazienti
(numero di campioni) (intermedi (intermedi
considerati considerati
Positivo Intermedio Negativo negativi) positivi)
68 pazienti (211 campioni)
51,5% 61,8%
presentanti almeno un’emocoltura 35 (86) 7 (14) 26 (111) 95% IC [39,0-63,8%] 95% IC [49,2-73,3%]
positiva a Candida spp.
- di cui 34 a C. albicans 64,7% 82,5%
22 (55) 6 (12) 6 (46)
(113 campioni) 95% IC [46,5-80,3%] 95% IC [65,5-93,2%]
- di cui 15 a C. parapsilosis 13,3% 20,0%
2 (3) 1 (1) 12 (33)
(37 campioni) 95% IC [1,7-40,5%] 95% IC [4,3-48,1%]
- di cui 12 a C. glabrata 58,3% 66,7%
7 (13) 0 (0) 5 (19)
(32 campioni) 95% IC [27,7-84,8%] 95% IC [34,9-90,1%]
- di cui 4 a C. tropicalis
4 (15) 0 (1) 0 (3) 100,0% * 100,0% *
(19 campioni)
- di cui 2 a C. krusei (8 campioni) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% *
- di cui 1 a C. norvegensis
0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% *
(2 campioni)
* : L’intervallo di confidenza del 95% non ha potuto essere calcolato a causa
delle dimensioni insufficienti dei campioni.
110Parallelamente al test Platelia™ Candida Ag Plus, questi stessi campioni
sono stati analizzati per la presenza di anticorpi anti-mannano con il
kit Platelia™ Candida Ab Plus 9. Lo stato del paziente per la presenza
dell’antigene mannano o di anticorpi anti-mannano specifici di Candida viene
considerato positivo se almeno uno dei due test è positivo. In assenza di test
positivo, lo stato viene considerato intermedio se almeno uno dei due test è
intermedio e negativo quando entrambi i test sono negativi.
Combinazione dei risultati con Platelia™ Candida Ag Plus e
Platelia™ Candida Ab Plus
Categorie di pazienti Numero di pazienti Sensibilità Sensibilità
(numero di campioni) (intermedi (intermedi
considerati considerati
Positivo Intermedio Negativo negativi) positivi)
68 pazienti (211 campioni)
presentanti almeno un’emocoltura 70,6% 82,4%
48 (122) 8 (40) 12 (49) 95% IC [58,3-81,0%] 95% IC [71,2-90,5%]
positiva a Candida spp.
- di cui 34 a C. albicans 82,4% 88,2%
28 (74) 2 (22) 4 (17)
(113 campioni) 95% IC [65,5-93,2%] 95% IC [72,6-96,7%]
- di cui 15 a C. parapsilosis 33,3% 73,3%
5 (7) 6 (15) 4 (15)
(37 campioni) 95% IC [11,8-61,6%] 95% IC [44,9-92,2%]
- di cui 12 a C. glabrata 91,7% 91,7%
11 (24) 0 (3) 1 (5)
(32 campioni) 95% IC [61,5-99,8%] 95% IC [61,5-99,8%]
- di cui 4 a C. tropicalis
4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0% * 100,0% *
(19 campioni)
- di cui 2 a C. krusei (8 campioni) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% *
- di cui 1 a C. norvegensis
0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% *
(2 campioni)
*: L’intervallo di confidenza del 95% non ha potuto essere calcolato a causa
delle dimensioni insufficienti dei campioni.
SPECIFICITÀ
La specificità è stata determinata su un pannello di 416 campioni, provenienti
da 2 siti situati in Francia, suddivisi nel modo seguente:
• Sito 1: 200 campioni provenienti da 200 pazienti francesi sottoposte a
monitoraggio sierologico della toxoplasmosi durante le loro gravidanze e
non presentanti alcun sintomo clinico d’infezione da Candida.
• Sito 2: 216 campioni provenienti da 216 pazienti francesi donatori di
sangue.
111Risultati con Platelia™ Candida Ag Plus
Numero di pazienti Specificità Specificità
Categorie di pazienti (numero di campioni) (intermedi (intermedi
considerati considerati
Positivo Intermedio Negativo positivi) negativi)
200 donne incinte (200 campioni)
sottoposte a monitoraggio 97,5% 98,5%
3 2 195 95% IC [94,3-99,2%] 95% IC [95,7-99,7%]
sierologico della toxoplasmosi
216 donatori di sangue 99,1% 99,5%
1 1 214
(216 campioni) 95% IC [96,7-99,9%] 95% IC [97,5-100%]
16- CONTROLLO DI QUALITÀ DEL PRODUTTORE
Tutti i prodotti fabbricati e commercializzati dalla società Bio-Rad sono
preparati conformemente ad un Sistema di qualità dal ricevimento delle
materie prime fino alla commercializzazione dei prodotti finali. Ogni lotto è
sottoposto ad un controllo di qualità e può essere commercializzato solo se
conforme ai criteri di accettazione prestabiliti. La documentazione relativa alla
produzione e al controllo di ogni singolo lotto è conservata dal produttore.
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Printed in France bio-rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2011 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881082 www.bio-rad.com
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