"I virus vegetali nella formulazione di un vaccino contro il virus HIV-1" - Carla Marusic
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“I virus vegetali nella
"Molecular Farming: formulazione di un
produzione di cibi funzionali,
di nutraceutici e vaccino
biofarmaceutici" contro il virus HIV-1”
ENEA - Casaccia
4 Dicembre 2003
Carla Marusic
UTS BIOTEC-GEN
ENEA - Trisaia
Piante come “biofabbriche” per la
produzione di vaccini
Vs
Molecole a scopo vaccinale espresse
in piante transgeniche
Vaccini in trial clinico Nature Reviews Genetics (2003)
Vol.4; 794-805
Trasformazione della cellula vegetale
1) Trasformazione
stabile mediata da
Cellula vegetale
Agrobacterium
Nucleo Nucleo
DNA della pianta Gene inserito
Proteina estranea
2) Trasformazione
transiente mediata da
Virus Vegetali (PVX)
Cellula vegetale
Nucleo Nucleo
Vettore virale
DNA della pianta Replicazione
del virus
Proteina estranea
Confronto tra due sistemi di espressione in pianta
Vaccine 19 (2001) 2735–2741
Strategie di clonaggio per l’espressione di
molecole vaccinali mediata da virus vegetali
Replicasi Movimento Proteina di
rivestimento
Genoma virale WT
Genoma virale modificato Gene estraneo
A)
+
B)
Particelle Virali Chimeriche
Molecole a scopo vaccinale espresse mediante
virus vegetali
Patogeno Pianta Proteina Sistema di Bibliografia
Espressione
Proteina di Trends
Virus di Norwalk Tabacco/ Virus vegetale
rivestimento del Biotechnol. 15,
Patata AMT
virus di Norwalk 441-444 (1997)
Engineering plants for
commercial products and
Influenza Tabacco Emoagglutinina Virus vegetale
applications (eds. Collins
TMV G.B. and Sheperd, R.J.) 1996
Tabacco/ Fagiolo HIV epitopo (gp120) Virus vegetale Curr. Opin. Biotechnol.
HIV 11, 199-204 (2000)
AMT/CPMV
N. benthamiana HIV epitopo (gp41) Virus vegetale J.Virol. Vol 75, 8434-
8439
PVX (2001)
proteina di Virus vegetale Microbes Infect. 1,
Streptococcus Tabacco 777-783 (1999).
superficie SpaA AMT
mutans
(agente della carie)Produzione di vaccini mediante esposizione su
virus vegetali, principali vantaggi :
•La produzione e validazione di un nuovo vaccino può essere ottenuta
in tempi molto brevi
•Facilità di manipolazione del genoma virale
•Elevati livelli di produzione di virus ricombinante per peso fresco
di tessuto infetto
•Purificazione del virus rapida ed efficiente
•Molti virus vegetali sono stabili a temperatura ambiente
•Ciascuna particella virale può esporre molte copie del frammento
proteico scelto (da 60 fino a 2,000 copie per virione)Programma Nazionale di Ricerca sull’AIDS
Progetto: Piante ingegnerizzate come
biofabbriche per la formulazione di vaccini.
Sviluppo di un vaccino anti HIV-1Vaccino contro HIV-1: una sfida • Il virus HIV-1 muta molto velocemente • Il virus deve essere bloccato in una fase precoce dell’infezione • Scelta dell’antigene, punti cruciali: • Variazioni nella conformazione delle proteine virali (isolati primari e ceppi di laboratorio). Attivazionedel sistema immunitario per indurre la produzione di anticorpi neutralizzanti capaci di bloccare il virus nelle primissime fasi dell’infezione. •Induzione di una risposta immunitaria di tipo cellulare con produzione di cellule del sistema immunitario specializzate in grado di eliminare il virus ed eventuali cellule infettate.
Proteine coinvolte nel processo di penetrazione del virus HIV-1 all’interno della cellula bersaglio
Modello della struttura della
glicoproteina gp41
‘Broadly Neutralizing Antibodies Targeted to the Membrane-Proximal External Region of
Human Immunodeficiency Virus Type 1 Glycoprotein gp41’
MICHAEL B. ZWICK et al. JOURNAL OF VIROLOGY, 2001, p. 10892–10905Particelle di virus X della patata (PVX) che
espongono sulla loro superficie una
porzione della proteina gp41 di HIV-1
Clonaggio della sequenza HIV-1 nel genoma del PVX
gp 41 (2F5)
HIV-1
•Ogni Particella Virale
Chimerica di PVX è
costituita da circa 1300
molecole di CP.
PVX-2F5Pianta infettata con il PVX-2F5
Purificazione del virus
CsCl gradient
Gli estratti di pianta reagiscono
con anticorpi umani anti HIV-1
1400
1200
1000
800
OD 405
600
400
200
0
C- WT-PVX PVX-2F5EImmunizzazione di topi con il virus PVX-2F5
Per via intraperitoneale Per via intranasale
Prelievi
Immunizzazioni
Giorni 0 14 28 42 56 70 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70Risposta immunitaria indotta dal virus PVX-2F5
PVX-2F5E WT-PVX
3500 IgG (Somministrazione IN)
3500
3000 3000
2500 2500
2000 2000
1500 1500
1000 1000
500 500
0 0
3500 3500
3000 IgG (Somministrazione IP) 3000
2500 2500
OD 405
2000 2000
1500 1500
1000 1000
500
500
0
0
1500 IgA (Somministrazione IN) 1500
1000
1000
500 500
0
14 28 42 56 70 0 14 28 42 56 70
GiorniIl PVX-2F5 induce la produzione di anticorpi umani
in un modello murino “umanizzato” SCID (Severe
Combined Immuno-Deficient Mice)
Immunizzazione
con le cellule Prelievi ed
Topo SCID ricostituito con cellule
dendritiche trattate analisi dei
umane del donatore sano
sieri
Prelievo da un
donatore sano
Identificazione di
Gradiente di densità
Anticorpi umani anti-HIV
1.6 Topi trattati
1.4 Topi controllo
1.2 Topi controllo
1.0
O.D.405 nm
0.8
Purificazione di cellule
mononucleate del sangue 0.6
periferico 0.4
Cellule Dendritiche
umane trattate con il 0.2
virus PVX-2F5 0
Giorni
10 17 25Saggio di Neutralizzazione del virus HIV-1
in vitro
100 M1
90
% Di Neutralizzazione
M4
80 H4
70
M7
60
H6
50
40
30
20
HIV-1IIIB
10
0
20 40 80 160 320
Diluizione del siero
Siero topi
SCID
Inibizione della formazione di
Siero topi sincizi indotta dal virus HIV-1
C57BL/10
Cellule in colturaProduzione di un vaccino mediante virus vegetali
1) Identificazione della sequenza di interesse
Gp41 epitopo 2F5
2) Clonaggio nel vettore virale
CsCl gradient
3) Infezione della pianta e purificazione del virus
4) Esperimenti di immunizzazione in modelli animaliConclusioni •LeParticelle Virali Chimeriche PVX-2F5 espongono un epitopo di HIV-1 altamente conservato. •Inducono una potente risposta immunitaria neutralizzante sia in topi normali che nel modello “umanizzato” SCID (Hu-PBL-SCID). •L’immunizzazione per via intranasale induce la produzione di alti livelli di anticorpi associati alle mucose (IgA). •La risposta immunitaria è stata ottenuta senza l’aggiunta di adiuvanti.
Manipolazione del PVX, infezioni di Modello SCID e saggi
pianta, purificazione del virus, di neutralizzazione in vitro.
analisi dei sieri. Immunizzazioni e
prelievi.
Brevetto Congiunto ENEA – ISS
Inventori: Benvenuto E., Marusic C., Belardelli F.
Rizza P., Capone I.
01.02.2002 EP 1 167 530 A3Progetti futuri
•Valutare l’efficacia del sistema PVX nell’induzione di risposte
immunitarie di tipo cellulare
• Capire l’effetto di PVX come adiuvante
•Valutare/verificare la sicurezza del sistema PVX in modelli
animali e nell’uomo
•Costruire nuove Particelle Virali Chimeriche per la formulazione
di un vaccino multicomponente
SIXTH FRAMEWORK PROGRAMME
PRIORITY [LSH-2002-1.2.5-2]
RECOMBINANT PHARMACEUTICALS FROM PLANT
FOR HUMAN HEALTH
(PHARMA-PLANTA)Collaboratori esterni Selene Baschieri Filippo Belardelli Chiara Lico Direttore del Laboratorio di Virologia Floriana Capuano Istituto Superiore di Sanita’, Camillo Mancini Roma Eugenio Benvenuto Responsabile di progetto
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