Effetti della temperatura di stoccaggio del latte crudo sulle caratteristiche di sicurezza e qualità del Provolone Valpadana DOP
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Relazione di progetto finale
Effetti della temperatura di stoccaggio del latte
crudo sulle caratteristiche di sicurezza e qualità
del Provolone Valpadana DOP
ACRONIMO DEL PROGETTO:
TEMPRO
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[Lodi 15/06/2021]
Allegato_8_Relazione_finale_Progetto_TEMPRO
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Indice
1. Progetto…………… ............................................................... ……………………………..3
2. Descrizione del progetto .................................................................................................. 5
3. Relazione intermedia/finale del progetto .......................................................................... 6
3.1.Obiettivi, benefici e criticità del progetto......................................................................... 7
4. Ostacoli occorsi ed azioni correttive messe in atto........................................................... 8
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1. Progetto
Dati generali
Effetti della temperatura di stoccaggio sulla sicurezza e qualità del latte crudo e
Titolo del progetto
sulle caratteristiche del Provolone Valpadana DOP
Acronimo del progetto TEMPRO
Area strategica di Area 4 - Qualità, tipicità e sicurezza degli alimenti e stili di vita sani
intervento1
Tecniche sostenibili per la trasformazione, conservazione e confezionamento dei prodotti
Linea di attività2
agroalimentari;
Settore produttivo3 Zootecnico
Tipo di progetto □ Bando □ Affidamento diretto □ Sportello
Riferimento del D.M. N. 27443 del 25/09/2018 - Selezione pubblica - progetti di ricerca fondo latte
Bando/Affidamento
diretto/Sportello
Durata del progetto 24
Costo ammesso 228.584,10
Contributo concesso 226.298,26
Importo rendicontato
Natura giuridica
Soggetto proponente il
progetto
Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria □ Pubblico
(CREA) - Centro di ricerca Zootecnia e Acquacoltura (ZA) Sede di Lodi
□ Privato
BUTTAZZONI Luca BTTLCU57C20L424Y (Direttore CREA-ZA e delegato per il
Rappresentante legale
rappresentante legale)
CONTARINI Giovanna CNTGNN56C55L682W (fino al 31/08/2020)
Coordinatore del progetto CARMINATI Domenico CRMDNC58H08E648I (dal 01/09/2020; DG DISR 04 - Prot. n.
0025763 del 09/07/2020)
Numero di Unità
Operative 2 due
ELENCO DELLE UNITÀ OPERATIVE
Natura giuridica
Unità Operativa n. 1 -
Denominazione
Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria □ Pubblico
(CREA) Centro di ricerca Zootecnia e Acquacoltura (ZA) Sede di Lodi.
□ Privato
Natura giuridica
Unità Operativa n. 2 -
Denominazione
Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria □ Pubblico
(CREA) Centro di ricerca Alimenti e Nutrizione (AN) Sede di Roma
□ Privato
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Numero di partner esterni
[Indicare a numero e in lettere]
al progetto
ELENCO DELLE UNITÀ OPERATIVE
Natura giuridica
Partner n. 1 -
Denominazione
□ Pubblico
□ Privato
Natura giuridica
Partner n. 2 -
Denominazione
□ Pubblico
□ Privato
L’esempio riportato nel presente modello è riferito a un numero di due unità operative e di due partner. Qualora il progetto
dovesse prevedere più unità operative o più partner aggiungere una riga per ogni unità operativa/partner.
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2. Descrizione del progetto
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Sintesi del progetto
Il Provolone Valpadana DOP, così come indicato nel Disciplinare, è un formaggio semiduro a pasta filata,
prodotto a partire da latte crudo di vacca intero, raccolto nella zona di origine da meno di 60 ore dalla prima
mungitura, ad acidità naturale di fermentazione. Nel caso della tipologia dolce può essere applicato un
trattamento di pastorizzazione, mentre nel caso della tipologia piccante è ammesso solo un trattamento di
termizzazione. La stagionatura minima è di 10 giorni per le pezzature inferiori a 6 kg e di 30 per le pezzature
superiori a 6 kg. Per le pezzature superiori ai 15 kg, riservate alla tipologia piccante, è richiesta una
stagionatura minima di 90 giorni e per quelle oltre i 30 kg con marchio P.V.S. (Provolone Valpadana
Stagionato) la stagionatura supera gli 8 mesi. L’elemento tecnologico che conferisce la diversità della tipologia
piccante da quella dolce è l’utilizzo del caglio in pasta di agnello o capretto, al posto del caglio di vitello. Il
Regolamento (CE) N. 853/2004, che stabilisce norme specifiche in materia di igiene per gli alimenti di origine
animale, riporta i requisiti per il latte crudo, le temperature di stoccaggio, dopo la mungitura, di trasporto e di
stoccaggio nell’azienda di trasformazione. In particolare, il latte, dopo la mungitura, deve essere
immediatamente raffreddato a una temperatura non superiore a 8°C in caso di raccolta giornaliera e non
superiore a 6°C qualora la raccolta non sia effettuata giornalmente. La catena del freddo dev'essere mantenuta
durante il trasporto e, all'arrivo presso lo stabilimento di destinazione, la temperatura del latte non deve
superare i 10°C. Inoltre, al momento dell'accettazione presso uno stabilimento di trasformazione, il latte deve
essere refrigerato ad una temperatura non superiore a 6°C e mantenuto a tale temperatura fino al termine
della trasformazione.
Il latte, dunque, qualora non sia trasformato “caldo”, deve essere refrigerato già alla stalla per bloccare o
rallentare la crescita della flora contaminante ambientale e di quella patogena eventualmente presente. Nel
latte e nei prodotti da esso derivati, la presenza generica di microrganismi di origine ambientale, anche in
elevate cariche, non solo è spesso la norma ma, a seconda delle specie microbiche e dei prodotti considerati,
può essere necessaria. Latte con scarso contenuto microbico (definito anche come latte “paucimicrobico”) è
stato ritenuto non idoneo per la produzione formaggi tradizionali a latte crudo e a lunga stagionatura, come,
ad esempio, il Provolone Valpadana DOP piccante. La refrigerazione, privilegiando o meno la biodiversità
microbica, potrebbe svolgere quindi un ruolo fondamentale sulla futura qualità del formaggio.
Il Consorzio di Tutela del Provolone Valpadana ritiene che l’incremento della temperatura di stoccaggio a 12°C
(che può essere considerato come una fase di prematurazione) possa favorire, nella materia prima, il
mantenimento di una carica microbica totale utile allo sviluppo di fermenti lattici, che risultano favorevoli in una
lavorazione acido-presamico, come quella del Provolone Valpadana. Inoltre, questo può essere determinante
nel mantenere il sieroinnesto ad elevata qualità ed alta attività fermentativa.
Un’incremento della temperatura di refrigerazione non può prescindere da un’attenta valutazione che tale
variazione ha, prima di tutto, sugli aspetti igienico sanitari del latte e del formaggio, che devono comunque
rispettare i criteri di sicurezza alimentare.
Il progetto si propone dunque di studiare gli effetti di un incremento della temperatura di refrigerazione del latte
crudo nell’ambito della filiera di produzione del Provolone Valpadana DOP della categoria piccante. Le
valutazioni riguarderanno non solo le caratteristiche microbiologiche, con particolare riferimento all’aspetto
igienico sanitario, ma anche le caratteristiche chimico fisiche e nutrizionali.
Lo schema operativo prevede nella prima fase:
• prelievo, in due diversi periodi dell’anno, del latte degli 11 produttori aderenti al Consorzio;
• stoccaggio del latte a 6 e 12°C per 60 ore;
• valutazione microbiologica atta a determinate la microflora lattica, i principali agenti patogeni e altri
contaminanti, con particolare riferimento alla flora psicrotrofa;
• analisi metagenomica (NGS) per valutare l’influenza della refrigerazione del latte sulla comunità microbica
complessiva del latte crudo
• valutazione dei principali costituenti del latte, inclusa la frazione minerale, e degli indici chimico fisici,
tecnologici, nutrizionali e dei processi proteolitici e lipolitici;
Al termine del periodo di stagionatura previsto per il Provolone DOP, si procederà a:
• campionamento formaggio della tipologia piccante di pezzatura < a 6 kg a 10, 30 e 60 giorni di stagionatura
e di pezzatura > di 6 kg a 30, 60 e 90 giorni di stagionatura.
• valutazioni microbiologiche e analisi metagenomica NGS
• valutazione dell’attività metabolica del microbiota del formaggio.
• valutazioni chimiche idonee alla determinazione dell’andamento della maturazione proteolitica e lipolitica e
al dosaggio degli zuccheri residui.
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• valutazione della digeribilità e della qualità nutrizionale nel formaggio.
Tutte le valutazioni effettuate hanno lo scopo principale di verificare l’effetto della variazione di temperatura di
stoccaggio sul latte e sul prodotto finito per accertare se questa variante tecnologica mantenga gli
indispensabili standard di sicurezza, possa contenere la crescita di microrganismi psicrotrofi e favorire una
prematurazione del latte che favorisca le successive fasi tecnologiche, nel rispetto delle caratteristiche del
prodotto finale.
Scegliere di dare un ruolo fondamentale alla flora del latte crudo come guida della qualità del formaggio
significa anche agire in difesa della tradizione e della tipicità e valorizzare quindi i prodotti DOP.
Poiché, come è previsto dal Reg. CE N. 853/2004, l'autorità competente può autorizzare “una temperatura
superiore per ragioni tecnologiche relative alla fabbricazione di taluni prodotti lattiero-caseari”, il Consorzio di
Tutela del Provolone Valpadana, in caso di risultati positivi, intende chiedere una modifica al disciplinare di
produzione.
Infine, non si ritiene sia di minore importanza, il fatto che l’applicazione di temperature di refrigerazione più
elevate comporti un minor impiego di energia con riduzione dei costi, migliorando la sostenibilità della filiera di
produzione.
3. Relazione finale del progetto
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SPAZIO RISERVATO AL COORDINATORE DEL PROGETTO
Relazione tecnico-scientifica (finale max 20 pagine)
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WP1 – Coordinamento
Nel corso del progetto sono state svolte le seguenti riunioni:
24/05/2019 Cremona, sede del Consorzio: Riunione preliminare con il Consorzio Tutela Provolone Valpadana
19/09/2019 CREA –ZA, Via Lombardo 11 – Lodi: Kick off meeting Progetto
17/12/2019 CREA –ZA, Via Lombardo 11 – Lodi: 2° meeting Progetto
10/09/2020 Workshop online – Risultati del 1° anno di attività del progetto TEMPRO
01/03/2021 CREA –ZA Lodi: 3° meeting conclusivo con i partner di Progetto (via web)
27/05/2021 Convegno online – Il Progetto TEMPRO
Nella redazione della relazione finale, per consentire di rispettare il numero di pagine a disposizione, non vengono ri-
portate tutte le tabelle con i singoli risultati, che sono comunque disponibili a richiesta.
WP2 – Influenza delle temperature di stoccaggio sulle caratteristiche del latte crudo
Attività 1: Campionamento del latte
Tutto il lavoro è stato svolto in stretta collaborazione con il Consorzio Tutela del Provolone Valpadana DOP (CTPV) che
ha fornito i campioni di latte di tutte le 11 aziende consorziate, provvedendo al prelievo e alla consegna al CREA di Lodi,
ed ha organizzato le caseificazioni sperimentali presso due aziende consorziate.
I campioni di latte (3 aliquote da 1 lt per ogni azienda), codificati con sigla della provincia e numero del caseificio, sono
stati prelevati in 2 diversi periodi: 1° campionamento dal 06/09/2019 al 24/10/2019; 2° campionamento dal 12/10/2020
al 16/11/2020. Al momento del prelievo, CTPV ha compilato una scheda riportante gli arrivi delle differenti autobotti
che avevano contribuito alla massa del latte prelevato, con relativi quantitativi e temperature.
I campioni mantenuti a 4°C e consegnati nel più breve tempo possibile al CREA di Lodi, sono stati poi oggetto di 4 diverse
prove di stoccaggio refrigerato secondo lo schema sotto riportato:
- 1° campionamento – a) 60 ore a 6°C; b) 60 ore a 12°C
- 2° campionamento – c) 15 ore a 10°C + 45 ore a 4°C; d) 15 ore a 12°C + 45 ore a 4°C
Sui campioni dopo stoccaggio, e su un controllo prelevato all’arrivo in laboratorio prima dello stoccaggio (t0) sono
state eseguite le analisi previste nel progetto, i cui risultati sono di seguito riportati.
Attività 2: Caratterizzazione microbiologica
I risultati delle conte microbiologiche effettuate sui campioni di latte del 1° e 2° campionamento sono riportati, come
dati medi, nelle Tabelle 1 e 3. I risultati della ricerca di microrganismi patogeni sono riportati nelle Tabelle 2 e 4. In Figura
1 sono riportati a confronto i dati medi dei 2 campionamenti oggetto delle due diverse condizioni di stoccaggio.
Tabella 1 - Analisi microbiologiche dei campioni di latte del 1° campionamento prima (t0) e dopo stoccaggio per 60 ore a 6°C (T60-6°)
e 12°C (T60-12°). Determinazioni quantitative, valori medi degli 11 campioni analizzati espressi in log UFC/ml (sotto in parentesi la
Deviazione Standard).
A,B,C Valori medi con lettera diversa sono significativamente differenti (P < 0,05)
Dei latti delle singole aziende del 1° prelievo effettuato nel 2019, ben tre campioni (BS16, CR88, VI44) presentavano già
al tempo t0, prima dello stoccaggio, una carica batterica totale (CBT) superiore a 5,0 log UFC/ml (pari a 100.000 UFC/ml)
limite previsto dal Reg. 853/2004 per il latte crudo di vacca alla stalla. Parimenti più elevata rispetto agli altri campioni
è risultata la carica dei batteri psicrofili, ma non quella delle altre classi microbiche. Dopo stoccaggio per 60 ore a 6°C e
soprattutto a 12°C (Tab. 1), in tutti i campioni sono stati rilevati importanti incrementi delle classi microbiche
considerate, eccetto per gli stafiloccocchi coagulasi positivi. Lo stoccaggio a 6°C per 60 ore ha contenuto lo sviluppo di
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batteri indici di scarsa igiene come Coliformi, E. coli e Stafilococchi coagulasi positivi, non è risultato sufficiente a limitare
il microbiota psicrofilo. Conseguentemente anche i valori di CBT arrivano a superare il limite di 300.000 UFC/ml (5,48
log UFC/ml) consentito dal Reg. N. 853/2004 per il latte crudo di vacca dopo stoccaggio in azienda e prima della
trasformazione. Dopo 60 ore a 12°C, 3 campioni (CR88, VI44, CR07), presentavano cariche di coliformi più elevate, > 6,0
log UFC/ml. Il campione VR48, dopo 60 ore a 12°C, ha invece evidenziato uno sviluppo più marcato di batteri lipolitici e
proteolitici (> di 7,0 log UFC/ml).
L’analisi della varianza (Tab. 1), ha dimostrato solo per Psicrofili e Pseudomonas incrementi statisticamente significativi
(P5,0 log UFC/ml).
Tabella 3 - Analisi microbiologiche dei campioni di latte del 2° campionamento prima (t0) e dopo 60 ore di stoccaggio (T6010°/4°: 15
ore 10°C + 45 ore 4°C; T6012°/4°: 15 ore 12°C + 45 ore 4°C). Determinazioni quantitative, valori medi (in parentesi la Deviazione
Standard) espressi in log UFC/ml. Conta delle spore di clostridi butirrici espressa in log UFC/L.
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A,B Valori medi con lettera diversa sono significativamente differenti (P < 0,05)
Dopo stoccaggio nelle nuove condizioni, 15 ore a 10°C o 12°C + 45 ore a 4°C (T6010°/4° - T6012°/4°), il limite di CBT
previsto dalla normativa (5,48 log UFC/ml) è risultato superato per 4 e 5 campioni, rispettivamente. Anche se i diversi
gruppi microbici hanno fatto registrare valori inferiori rispetto a quelli determinati dalle condizioni di stoccaggio del 1°
campionamento, gli aumenti di CBT, Batteri psicrofili, lipolitici, proteolitici e Pseudomonas rispetto alle cariche a t0 sono
comunque risultati significativamente diversi (Tab. 3). La componente psicrofila della microflora, rappresentata per la
maggior parte da Pseudomonas, in 15 ore di stoccaggio a 10° e 12°C è aumentata di circa 100 volte; questo ha
comportato un aumento di circa 10 volte della CBT, con valore medio comunque contenuto entro i limiti previsti dalla
normativa. Per i Coliformi, la carica aumentava significativamente di oltre 10 volte a T 6012°/4° ma non a T6010°/4°. Per i
batteri lattici, E. coli, stafilococchi coagulasi positivi e spore di clostridi butirrici non si sono registrati incrementi medi
significativi (Tab. 3). Relativamente ai patogeni (Tab. 4), L. monocytogenes è stata ritrovata in 2 campioni a t0 e dopo
stoccaggio. E. coli STEC (produttori di tossine) è stata ritrovata in 1 campione a t0. Per B. cereus, la ricerca effettuata è
risultata positiva in un solo campione con cariche di 1,0 log UFC/ml sia prima che dopo stoccaggio.
Tabella 4 – Ricerca di batteri patogeni nei campioni di latte del 2° campionamento, prima (t0)
e dopo stoccaggio a 10°C (T6010°/4°) e 12°C (T6012°/4°) per 15 ore e altre 45 ore a 4°C.
Dal confronto dei dati delle 4 prove di stoccaggio, anche se effettuate su campioni di latte prelevati in due anni diversi,
si sono potute ricavare indicazioni importanti con potenziali ricadute operative (Fig. 1). Le modifiche apportate alle
condizioni di refrigerazione, cioè lo stoccaggio a 10° o 12°C per 15 ore e successive altre 45 ore a 4°C, si è dimostrato
mediamente compatibile per consentire il rispetto dei limiti di carica microbica consentiti dalla normativa. Dall’analisi
dei singoli campioni, si è comunque confermata determinante la qualità igienica iniziale del latte alla stalla. Solo un latte
con carica microbica inferiore al limite di 105 ufc/ml è in grado di poter essere stoccato per 60 ore nelle condizioni
applicate. Per quanto riguarda i batteri patogeni, L. monocytogenes e E. coli STEC, uno stoccaggio per 60 ore nelle di-
verse condizioni termiche studiate non ha determinato variazioni rispetto al profilo igienico del latte prima della con-
servazione.
Figura 1 – Confronto dati microbiologici delle diverse prove di stoccaggio per i latti del 1° e 2° campionamento. Valori medi degli 11
campioni analizzati, espressi in log UFC/ml (in log spore/litro per i clostridi butirrici). La linea rossa tratteggiata indica il valore di carica
batterica totale previsto dal Reg. N. 853/2004 per il latte crudo di vacca immediatamente prima della trasformazione dopo stoccaggio
in caseificio (300.000 UFC/ml; 5,48 log UFC/ml).
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L’analisi metagenomica per valutare l’influenza dello stoccaggio sulla composizione della comunità microbica del latte
crudo è stata effettuata su tutti i 33 campioni di latte del 2° campionamento e su 12 del 1° campionamento. Per con-
sentire l’estrazione del DNA dalle cellule microbiche, 45 ml di latte sono stati pre-trattati per eliminare i residui di grasso,
quindi dai pellet cellulari è stato estratto il DNA con estrattore automatico QIacube HT (Qiagen). L’analisi NGS è stata
effettuata in outsourcing da IGA Technology (Udine) mediante sequenziamento della regione V3-V4 del gene 16SrRNA.
I risultati acquisiti come OTUs (Operational Taxonomic Units) sono stati prima normalizzati, escludendo le OTUs con nu-
mero di reads < 5, ed è stata poi eseguita l’analisi bioinformatica con software RStudio 3.5.2 (R Core Team), per identi-
ficare le specie microbiche e loro abbondanza relativa espressa in numero di reads presenti in ciascun campione.
L’analisi metagenomica di 4 campioni di latte del 1° campionamento, prima dello stoccaggio (t0), e dopo 60 ore a 6°C
(T60h6°) e 12°C (T60h12°) ha evidenziato un’elevata biodiversità della comunità microbica, con 64 taxa dominanti (abbon-
danza relativa >1%) e 151 taxa secondari (abbondanza relativa compresa fra 1% e 1‰). La biodiversità microbica varia
a seconda dei caseifici di provenienza (Fig. 2). Le specie più abbondanti sono Lactococcus sp., Lactococcus raffinolactis
e Pseudomonas viridiflava, anche se con una presenza differente fra i vari latti esaminati. Il trend costante rilevato in
tutti i campioni è l’aumento dell’abbondanza relativa delle specie dominanti con l’aumento della temperatura di refri-
gerazione.
Figura 2 - Abbondanza relativa media delle prime 15 specie microbiche do-
minanti (≥ 1 %) presenti nei campioni di latte, in funzione della tempera-
tura.
L’analisi statistica della biodiversità presente nei campioni di latte sulla base di 2 indici microbici (Richness e Shannon Di-
versity) che tengono conto del numero di specie presenti e della loro diversità, non ha evidenziato differenze significa-
tive tra le comunità microbiche rilevate dopo lo stoccaggio a diversa temperatura (Fig. 3). I risultati dell’analisi metage-
nomica di tutti gli 11 campioni di latte del 2° campionamento sono stati sottoposti ad analisi statistica multivariata sia
delle componenti principali (PCA) che delle coordinate principali (PCoA) per valutare la significatività della diversità mi-
crobica del latte prima (t0) e dopo stoccaggio a 10°C/12°C per 15 ore e a 4°C per altre 45 ore (T6010°/4°; T6012°/4°).
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Figura 3 – Diversità delle comunità microbi-
che del latte prima (t0) e dopo stoccaggio
(T60h6°, T60h12°).
t0 T60 6° T60 12°
t0 T60 6° T60 12°
Mentre l’analisi PCA non ha evidenziato differenze significative, l’analisi PCoA ha permesso, tramite raffigurazione con
β-dispersion plot (Fig. 4), di evidenziare differenze significative delle comunità microbiche del latte dopo stoccaggio a
10°C e 12°C rispetto a quelle presenti al t0.
Figura 4 – Analisi differenziale (PCoA) considerando i dati di tipizza-
zione delle comunità batteriche presenti nei campioni dei latti prima
e dopo stoccaggio.
Successivamente, per cercare di estrapolare un’informazione dal numero di specie microbiche e dalla loro rappresen-
tatività nei campioni di latte esaminati, è stata valutata l’abbondanza microbica relativa dei vari campioni di latte. Tutti
i 33 campioni presentano un’elevata biodiversità microbica (Fig. 5) che varia a seconda dei caseifici di provenienza: sono
stati identificati 86 taxa dominanti e 272 taxa secondari. Le specie con un’abbondanza relativa maggiore sono Lactococ-
cus sp., Lc. raffinolactis e Acinetobacter johnsonii, anche se differenti fra i vari latti esaminati. Il trend costante, che si
rileva in tutti i campioni, è l’aumento dell’abbondanza relativa delle specie dominanti nel latte dopo stoccaggio rispetto
al latte prima di essere stoccato (t0).
Figura 5 - Abbondanza relativa media
delle prime 15 specie microbiche dominanti (≥
1 %) presenti nei campioni di latte in funzione
della temperatura di stoccaggio.
La diversità microbica totale presente nei campioni di latte sulla base dei due indici microbici (Richness e Shannon Di-
versity), non è comunque risultata significativa in funzione delle diverse condizioni di stoccaggio applicate.
Le comunità microbiche dei campioni di latte del 2° campionamento, oltre alla caratterizzazione metagenomica, sono
state analizzate con l’Omnilog Phenotype Microarray System (Biolog) per valutarne le attività metaboliche (fenoma).
Sono state utilizzate le micropiastre Ecoplate, specificamente sviluppate per lo studio del metabolismo microbico di
comunità complesse, e sono stati analizzati gli 11 campioni di latte prima (t0) e dopo stoccaggio T6010°/4°C e T6012°/4°C.
Le piastre Ecoplate sono costituite da 31 substrati differenti di 5 diverse classi: carboidrati, acidi carbossilici, aminoacidi,
polimeri e ammine. Le cellule microbiche, estratte da 20 ml di latte dopo trattamento con sodio citrato, sono state
recuperate per centrifugazione, risospese in soluzione fisiologica e inoculate (150 μl) nei pozzetti delle piastre EcoPlate.
Dopo incubazione a 30°C per 60 ore, il grado di utilizzazione del substrato era evidenziato dall’intensità dell’indicatore
di colore e misurato a 590 nm.
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I dati di attività metabolica delle popolazioni microbiche dei 33 campioni di latte sono stati sottoposti ad analisi statistica
per valutare le differenze significative nella variabilità microbica dei campioni di latte alla consegna in laboratorio,
rispetto a quella dei latti dopo. I risultati (riportati come esempio 2 campioni in Fig. 6) evidenziano una elevata
biodiversità nell’attività delle comunità microbica dei campioni in esame con un aumento dell’attività metabolica
all’aumentare della temperatura di stoccaggio del latte, evidenziando come le comunità microbiche aumentano in
quantità, ma le stesse sono anche più attive.
Figura 6 - Attività microbica di due cam-
pioni di latte: al t0 (a), dopo stoccaggio
T6010°/4°C (b) e T6012°/4°C (c). Mag-
giore è l’intensità del colore, maggiore
è l‘attività della comunità microbica.
Attività 3: Analisi chimico-fisiche e Attività 4: Valutazione dell’attitudine alla caseificazione
Per omogeneità e chiarezza di esposizione i risultati di queste due attività vengono relazionate insieme. In Tab. 5 sono
riportati i risultati delle analisi eseguite sul latte del 1° e del 2° campionamento.
Il latte del 1° campionamento al tempo zero (t0) ha mostrato valori medi di pH e acidità rispettivamente di 6.73±0.02 e
3.42±0.12 °SH/50. La conservazione a 12°C per 60 ore (T6012°C) ha causato importanti variazioni in entrambi i parametri,
sebbene non statisticamente significative, con una diminuzione del valore medio di pH, un aumento di acidità e un
incremento della dispersione dei valori. Notevole influenza sui risultati hanno avuto alcuni campioni, in particolare BS16,
il cui valore di pH è sceso a 5.24 ed ha fornito valori decisamente anomali anche nell’acidità (13.4 °SH/50). Altri due
campioni hanno presentato valori di pH sotto 6.60 (CR88=6.47; VR48=6.30) e valori più elevati di acidità rispetto alla
media degli altri campioni a T6012°C (CR88=4.45 e VR48=5.15 °SH/50). Al contrario, dopo conservazione a 6°C (T606°C) si
è osservato un minore scostamento dal t0 dei valori medi di pH e acidità e una minore variabilità nei valori registrati. In
via esplorativa, sul latte di 5 produttori che non avevano evidenziato anomalie (TN69, VI41, CR01, CR07 e CR28) a T606°C
e T6012°C, è stata effettuata in outsourcing la determinazione del contenuto in minerali. Solo il contenuto in calcio è
risultato significativamente più elevato (PConsiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria
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Tabella 5 - Analisi chimico-fisiche e prove di coagulazione del latte del 1° e 2° campionamento; valori espressi come media ± DS.
TC=tempo di coagulazione (min), k20=velocità di presa (min), A30=consistenza del coagulo a 30 min dall’aggiunta del caglio (mm).
Per ciascun campionamento, lettere diverse all’interno di ciascuna riga indicano valori significativamente diversi (PConsiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria
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temperatura di stoccaggio. Per ciò che riguarda la frazione volatile, i dati del latte del 2° campionamento confermano
una discreta variabilità tra i diversi produttori, seppur ridotta rispetto a quanto osservato nel primo prelievo. Si è
osservato nel corso dello stoccaggio un leggero incremento del contenuto medio in acidi volatili dopo 60 ore (t0: 10.0;
T6010°/4°C: 13.2; T6012°/4°C: 12.4), ma questa differenza non è risultata statisticamente significativa. Da segnalare come
il latte dei caseifici VR48 e BS25 abbia mostrato valori un po’ più elevati in acidi totali rispetto agli altri. I campioni
conservati con il nuovo gradiente di temperatura non hanno manifestato fenomeni proteolitici: solo il contenuto in
proteoso peptoni ha subito un significativo incremento (PConsiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria
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testate nell’ambito del WP2. Per quanto riguarda le pezzature del formaggio, in accordo con il CTPV si è scelto di mettere
a confronto due pezzature molto diverse come peso, una ≤ 6 kg e una ≤ 30 kg, per le quali il disciplinare prevede tempi
minimi di stagionatura di 10 e 90 giorni, rispettivamente. Per la prima prova sperimentale di caseificazione (A), condotta
nel 2019 presso l’azienda CR04 dotata di serbatoi coibentati, è stato utilizzato latte crudo stoccato sia a 6°C per 60 ore
(prova effettuata il 06/11/2019) che a 12°C per 60 ore (prova effettuata il 13/11/2019). Per la seconda prova sperimen-
tale di caseificazione (B), condotta nel 2020 presso l’azienda CR28 dotata di serbatoi termostatati, è stato utilizzato latte
crudo stoccato sia a 10°C per 15 ore e a 4°C per 45 ore (prova effettuata il 17/02/2020) che a 12°C per 15 ore e a 4°C
per 45 ore (prova effettuata il 25/02/2020).
Tutti i formaggi prodotti sono poi stati prelevati in tre diversi momenti nel corso della stagionatura in funzione della
pezzatura e del peso del prodotto:
- Provolone Valpadana DOP di pezzatura ≤ a 6 kg sono stati campionati a 10, 30 e 60 giorni;
- Provolone Valpadana DOP di pezzatura ≤ 30 kg sono stati campionati a 90, 120 e 180 giorni.
Per entrambe le caseificazioni sperimentali è stato prelevato ed analizzato anche il latte in caldaia, prelevato prima
dell’inizio della lavorazione.
Attività 2: Caratterizzazione microbiologica
Un primo confronto dei risultati delle analisi microbiologiche del latte stoccato in caseificio e utilizzato per le caseifica-
zioni sperimentali rispetto al latte delle stesse aziende stoccato in laboratorio nelle stesse condizioni (attività WP2), ha
permesso di evidenziare come le condizioni estreme di stoccaggio del 1° campionamento (6° e 12°C per 60 ore), già
dimostratesi critiche dalle prove di laboratorio, applicate a livello industriale hanno compromesso ulteriormente le ca-
ratteristiche microbiologiche. Le motivazioni sono da ascriversi principalmente allo stoccaggio in serbatoi coibentati del
caseificio CR04 che non ha consentito di mantenere la temperatura del latte a 6° e 12°C per 60 ore, ma sono stati
registrati scostamenti di circa 2°C. L’effetto di questa variazione di temperatura è evidente dai risultati dei latti in caldaia
che hanno mostrato una degradazione superiore rispetto ai corrispondenti latti stoccati in condizioni controllate. La
problematica è stata risolta effettuando la seconda prova di caseificazione nel 2020 presso l’azienda CR28 dotata di
serbatoi termostatati. In questo modo è stato possibile rispettare le condizioni di stoccaggio previste per il 2° campio-
namento (10°C e 12°C per 15 ore più altre 45 ore a 4°C) che erano state modificate per consentire una maggior rappre-
sentatività delle reali situazioni produttive, come relazionato nell’attività WP2. La conferma che le azioni correttive ap-
portate, cioè la modifica delle condizioni di stoccaggio e la scelta di un diverso impianto dove effettuare le prove speri-
mentali di caseificazione, hanno consentito di risolvere le criticità rilevate come dimostra il confronto dei risultati ripor-
tati in Tab. 6.
Le condizioni di stoccaggio applicate per la 1a prova hanno portato ad avere un latte da caseificare con una carica bat-
terica totale (CBT) superiore a 6,0 log UFC/ml (T606°) e 7,0 log UFC/ml (T6012°), valore 100-1000 volte superiore al limite
massimo previsto dal Reg. N. 853/2004 per il latte crudo di vacca dopo stoccaggio in caseificio (5,48 log UFC/ml). Tali
valori sono risultati anche superiori a quelli ottenuti dalle prove di laboratorio a conferma che le condizioni operative
del caseificio, non garantendo una temperatura costante per 60 ore, non erano idonee per raggiungere l’obiettivo.
Le condizioni di stoccaggio adottate per la 2a prova, invece, hanno permesso di mantenere le caratteristiche microbio-
logiche del latte nei limiti previsti non solo nei test di laboratorio, ma anche in azienda, a conferma che i rapporti
tempo/temperatura applicati e le strutture aziendali (serbatoi termostatabili) consentivano il controllo della qualità
igienica del latte per tutte le 60 ore di stoccaggio previste. Resta comunque da evidenziare come in entrambe le prove,
i batteri patogeni come E. coli STEC e L. monocytogenes non siano mai stati ritrovati nonostante le differenti modalità e
temperature di stoccaggio.
I formaggi prodotti nelle due diverse prove di caseificazione sono stati monitorati nel corso della stagionatura per i
parametri di rilevanza igienico-sanitaria: indicatori di scarsa igiene (Coliformi, E. coli, Pseudomonas, Stafilococchi coa-
gulasi positivi) e indici di sicurezza (L. monocytogenes, E. coli STEC).
Per i formaggi prodotti nel 2019, nonostante le elevate cariche microbiche del latte dopo stoccaggio per 60 ore a 6° e
12°C (Tab. 6), il profilo microbiologico dei formaggi non è risultato compromesso (Tab. 7). L’elevata CBT iniziale dimi-
nuiva progressivamente all’aumentare del tempo di stagionatura (dai 10 gg di stagionatura minima dei formaggi di pic-
cola pezzatura, ai 180 gg di stagionatura massima dei formaggi di grande pezzatura), ma i gruppi microbici di interesse
igienico sono invece sempre risultati inferiori ai valori soglia di sensibilità dei metodi di conta (< 2,0 log UFC/g).
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Tabella 6 – Analisi microbiologiche del latte stoccato in caseificio e prelevato in caldaia prima della caseificazione, in confronto con il
latte dei medesimi produttori dopo prove di stoccaggio in condizioni di laboratorio.
1° prova - 2019 2° prova - 2020
latte azienda CR04 latte azienda CR28
dopo stoccaggio T606° dopo stoccaggio T6012° dopo stoccaggio T6010°/4° dopo stoccaggio T6012°/4°
laboratorio caseificio laboratorio caseificio laboratorio caseificio laboratorio caseificio
13/09/2019 06/11/2019 13/09/2019 13/11/2019 19/10/2020 17/02/2020 19/10/2020 25/02/2020
CBT mesofili 5,12 6,88 6,81 7,88 4,65 4,53 4,41 4,45
Batteri psicrofili 5,03 6,20 6,68 7,22 3,90 3,66 3,81 4,21
Batteri lattici 3,02 3,87 5,89 6,55 2,39 2,72 2,31 2,82
Batteri lipolitici 3,93 6,16 5,64 7,41 3,95 4,23 4,00 4,13
Batteri proteolitici 4,40 1,00 5,19 7,69 2,98 2,85 3,28 2,87
Pseudomonas log UFC/ml 5,51 4,00 6,88 5,86 3,64 3,61 4,24 4,70
E. coli 1,74 1,85 4,81 3,00 2,30 2,07 2,88 1,95
Coliformi totali 2,24 3,30 5,26 3,98 3,12 1,00 3,29 2,05
Stafilococchi coag. positiviConsiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria
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L’analisi metagenomica per studiare l’evoluzione delle comunità microbica in formaggio è stata effettuata su tutti i cam-
pioni della 2° prova di caseificazione. I dati ottenuti dall’analisi metagenomica dei 12 campioni di formaggio Provolone
Valpadana prodotto con latte mantenuto a 10°C o 12°C per 15 ore, raffreddato a 4°C e stoccato per altre 45 ore, hanno
evidenziato un’elevata biodiversità della comunità microbica nei rispettivi campioni di latte rispetto a quella dei for-
maggi (Fig. 9). Valutando nel dettaglio la comunità microbica dei campioni di formaggio si è rilevata la presenza di soli 6
taxa dominanti (abbondanza relativa >1%) e 10 taxa secondari (abbondanza relativa compresa fra 1% e 1‰). Come si
osserva in Fig. 10, fra le specie dominanti si ritrovano quelle caratteristiche di questo prodotto quali Lactobacillus del-
brueckii, Streptococcus thermophilus e Lactobacillus helveticus, mentre fra le specie secondarie si trovano Lactobacillus
buchneri, Lactobacillus rhamnosus e Clostridium tyrobutyricum indipendentemente dalla temperatura di refrigerazione
del latte di partenza.
Figura 9 - Abbondanza relativa media delle prime 15 specie
microbiche dominanti (≥ 1 %) presenti nei campioni di for-
maggio Provolone e dei rispettivi campioni di latte in fun-
zione della temperatura.
Figura 10 - Abbondanza rela-
tiva media delle specie micro-
biche dominanti (a) e seconda-
rie (b) presenti nei campioni di
formaggio Provolone in fun-
zione della temperatura
a b
Da ultimo, al fine di studiare la biodiversità microbica totale presente nei campioni di formaggio prodotti con il latte a
due temperature di refrigerazione sono stati utilizzati anche due indici microbici (Richness e Shannon Diversity) che
hanno evidenziato entrambi una differenza significativa, con una maggiore biodiversità ed uniformità di specie per i
campioni di Provolone prodotti con il latte refrigerato a 12°C per 15 ore e stoccato per altre 45 ore a 4°C (Figura 11).
Figura 11 – Indici microbici: Richness e
Shannon Diversity applicati alla comu-
nità microbica presente nei formaggi
prodotti con latte stoccato in due di-
verse condizioni di refrigerazione.
I campioni di formaggio della 2a dovevano essere oggetto anche di analisi delle attività metaboliche complessive del
microbiota (fenoma) mediante Omnilog Phenotype Microarray System (Biolog). Le cellule microbiche recuperate dai
formaggi ai vari tempi di stagionatura non sono risultate in grado di utilizzare i substrati del sistema Omnilog, con risul-
tati sempre totalmente negativi. Le cause potrebbero essere ascritte allo stato di stress delle cellule microbiche, al nu-
mero non sufficiente di cellule vive e vitali (sono necessarie 105 cell), alla presenza solo di cellule di batteri lattici dello
starter non attive sui substrati del sistema Ominolg. Per tali motivi, in alternativa, si sono studiate le attività metaboliche
delle comunità microbiche dei latti del 2° campionamento come riportato nella sezione specifica (WP2, attività 2).
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Attività 3: Caratterizzazione chimica e valutazione dei processi di maturazione mediante analisi chimico-fisiche
Il latte impiegato per la 1a caseificazione ha risentito dello sviluppo microbico elevato e ha subito variazioni nei parametri
chimico-fisici più legati a questo aspetto: pH, acidità, contenuto di lattosio e attitudine alla coagulazione (TC, K20, A30)
confermano un’acidificazione maggiore del latte conservato presso il caseificio rispetto al campione stoccato per 60 ore
in laboratorio. Variazioni maggiori si sono registrate soprattutto per il latte T 60 12°C, sebbene non si siano manifestati
fenomeni proteolitici rilevanti. Al contrario, il latte della 2a caseificazione è risultato perfettamente allineato al latte del
medesimo caseificio prelevato durante il 2° campionamento e conservato in laboratorio e non ha evidenziato variazioni
nei parametri chimico-fisici dopo stoccaggio né a 10° né a 12°C.
La Tabella 8 riporta i dati di composizione chimica e delle frazioni azotate dei formaggi prodotti nel corso rispettivamente
della 1a (A) e della 2a (B) caseificazione.
Tabella 8 - Dati di composizione chimica e frazioni azotate dei formaggi prodotti nel corso rispettivamente della 1a (A) e della 2a (B)
caseificazione. SS: sostanza secca; NCN: azoto non caseinico; NPN: azoto non proteico; Ntot: azoto totale; AAL: amminoacidi liberi.
A) PEZZATURA PICCOLA PEZZATURA GRANDE
T latte T60h6°C T60h12°C T60h6°C T60h12°C
Giorni 10 30 60 10 30 60 90 120 180 90 120 180
SS % 58.03 61.57 62.92 59.71 60.23 62.73 60.17 62.41 63.87 62.02 62.26 62.85
Grasso % 29.56 32.58 32.70 30.71 30.97 32.19 30.51 31.36 32.34 32.40 31.47 31.78
Grasso/SS % 50.95 52.92 51.98 51.44 51.43 51.32 50.70 50.24 50.63 52.24 50.54 50.57
Proteine % 23.40 24.89 25.50 24.55 24.60 25.73 24.17 25.82 25.41 24.48 25.18 25.47
Ceneri % 3.57 3.72 4.16 3.82 3.85 4.03 4.43 3.79 5.11 4.65 4.56 4.58
Lattosio (mg/100g) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Glucosio (mg/100g) 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Galattosio (mg/100g) 12 2 1 109 15 2 2 2 3 10 1 1
NCN % 1.58 2.37 3.27 1.64 2.71 3.88 3.92 3.87 4.35 3.91 4.44 5.31
NPN % 1.13 1.98 2.97 1.00 1.92 3.10 3.61 3.49 3.95 3.36 3.86 4.64
NCN/Ntot*100 6.75 9.52 12.82 6.68 11.00 15.08 16.21 14.97 17.11 15.96 17.61 20.83
NPN/Ntot*100 4.83 7.96 11.66 4.05 7.81 12.05 14.95 13.51 15.53 13.71 15.33 18.22
AAL (mg/100g proteine) 1322 2453 5260 1074 3218 4200 8163 9377 10610 6672 8796 10089
s1-caseina (g/100g) 7.10 6.53 5.65 6.63 4.39 3.79 4.80 4.31 4.04 4.01 2.53 2.55
-caseina (g/100g) 8.95 8.47 7.56 9.32 8.22 5.37 6.65 6.05 6.10 6.71 3.52 4.71
-caseina (g/100g) 0.91 1.50 1.87 1.07 1.62 2.21 1.64 1.98 2.20 1.88 2.81 3.56
s1-I caseina (g/100g) 0.57 1.32 1.91 1.32 2.74 2.46 1.47 2.70 1.69 1.70 4.45 1.76
degradazioni (g/100g) 0.48 1.05 1.50 0.58 1.38 4.33 1.65 2.25 2.14 2.68 3.05 3.19
B) PEZZATURA PICCOLA PEZZATURA GRANDE
T latte T60h10°/4°C T60h12°/4°C T60h10°/4°C T60h12°/4°C
Giorni 10 30 60 10 30 60 90 120 180 90 120 180
SS % 60.52 65.42 66.10 61.42 64.45 64.83 64.03 63.56 65.77 64.12 63.55 65.58
Grasso % 29.83 32.40 32.61 29.65 32.10 32.66 31.68 30.02 32.54 32.10 29.70 32.34
Grasso/SS % 49.28 49.52 49.34 48.27 49.80 50.38 49.48 47.22 49.47 50.06 46.73 49.31
Proteine % 26.32 27.63 27.99 25.59 27.77 26.75 27.00 26.89 27.89 26.59 26.68 27.49
Ceneri % 4.26 4.88 5.02 4.32 4.88 4.78 4.77 4.59 4.95 4.77 4.65 4.74
Lattosio (mg/100g) 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0
Glucosio (mg/100g) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Galattosio (mg/100g) 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0
NCN % 1.80 2.51 2.44 1.66 2.17 2.66 3.15 3.52 3.81 3.32 3.35 4.22
NPN % 1.53 2.31 2.33 1.28 1.97 2.36 2.89 3.14 3.54 3.19 3.13 4.05
NCN/Ntot*100 6.84 9.09 8.70 6.47 7.82 9.94 11.7 13.1 13.6 12.5 12.6 15.4
NPN/Ntot*100 5.80 8.35 8.31 5.00 7.07 8.81 10.7 11.7 12.7 12.0 11.7 14.7
AAL (mg/100g proteine) 1470 3328 4947 1133 2255 3552 7324 7642 7126 7619 7609 8927
s1-caseina (g/100g) 7.86 7.45 7.31 7.53 7.57 6.76 5.78 5.53 5.14 5.65 5.08 4.62
-caseina (g/100g) 10.25 10.13 9.98 10.32 10.41 9.70 8.84 8.60 8.48 8.81 8.65 7.89
-caseina (g/100g) 0.65 0.74 1.04 0.62 0.89 0.90 1.04 1.06 1.42 1.07 1.18 1.32
s1-I caseina (g/100g) 0.45 0.74 1.04 0.30 0.79 0.91 1.58 1.52 1.63 1.43 2.00 1.64
degradazioni (g/100g) 0.56 0.76 0.88 0.47 0.73 0.78 1.73 1.90 2.15 1.45 1.66 2.14
Secondo le indicazioni del Disciplinare di produzione del Provolone Valpadana per la tipologia piccante, il tenore mas-
simo di acqua nel formaggio non deve essere superiore al 46% per le forme fino a 6 kg, e al 43% per quelle oltre i 6 kg.
Inoltre, per tutte le produzioni, grasso/SS non può essere inferiore al 44% e superiore a 54%. Tutti i formaggi prodotti
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rientravano nei parametri indicati dal Disciplinare, e l’andamento del contenuto in grasso, proteine e ceneri nel corso
della stagionatura non ha risentito della diversa temperatura di stoccaggio del latte. Per quanto riguarda la composi-
zione in zuccheri, per il normale processo di produzione e stagionatura, il Provolone risulta naturalmente privo di latto-
sio già dopo 10 giorni di maturazione, indipendentemente dalla modalità di conservazione del latte usato per la caseifi-
cazione. Una leggera differenza è stata invece riscontrata nel corso della 1a prova, relativamente al contenuto in galat-
tosio: per entrambe le pezzature, ed in maniera più marcata per i formaggi prodotti con latte T 6012°C, si è osservato un
rallentamento nel metabolismo del galattosio, che viene degradato più lentamente e risulta presente in tracce anche
dopo 180 giorni. Nei Provoloni della 2a prova, invece, già dopo 10 giorni il galattosio risulta quasi completamente de-
gradato. Questo risultato potrebbe essere la conseguenza delle modalità di stoccaggio del latte, che hanno indotto la
selezione di una microflora con caratteristiche diverse riguardo la capacità di metabolizzare gli zuccheri. Nel corso della
stagionatura i formaggi subiscono una serie di trasformazioni a carico dei principali costituenti che contribuiscono al
raggiungimento delle caratteristiche proprie di ciascun prodotto. Tra questi uno dei fenomeni più importanti è la pro-
teolisi, ossia una progressiva degradazione della matrice caseinica. La formazione di peptidi ad alto peso molecolare
(proteolisi primaria), è causata soprattutto dalla plasmina, enzima endogeno del latte, e dagli enzimi residui del caglio,
i cui effetti però dipendono dalla percentuale di enzimi trattenuti nella cagliata e dalla loro attività residua in seguito
alle operazioni di cottura e di filatura. Un’indicazione del livello di proteolisi primaria è data dal valore di azoto non
caseinico rispetto alle proteine totali (NCN/Ntot%). Nella 1a lavorazione, sebbene i dati per le due pezzature siano ini-
zialmente sovrapponibili, nel corso della maturazione si osserva un andamento divergente, con valori superiori nei cam-
pioni prodotti con latte T6012°C, maggiormente proteolizzati. L’analisi in elettroforesi capillare evidenzia una degrada-
zione sia della β- che dell’αs1-caseina per azione della plasmina e del caglio, come confermano gli specifici prodotti di
reazione (ϒ- e αs1-I caseine), soprattutto per i campioni prodotti con T6012°C. Nella seconda lavorazione i formaggi
complessivamente hanno mostrato un grado di proteolisi primaria (NCN/Ntot%) inferiore rispetto alla prima caseifica-
zione, ed inoltre, per entrambe le pezzature, le differenze tra formaggi prodotti con latte stoccato a diverse temperature
si sono ridotte, come confermato anche dai risultati dell’analisi elettroforetica. I tracciati hanno inoltre evidenziato al-
cune degradazioni di tipo aspecifico, non direttamente riconducibili all’azione di specifici enzimi, evidenti soprattutto
nei campioni della 1a lavorazione prodotti con latte T6012°C.
Gli spezzoni liberati nella prima fase della maturazione diventano poi il substrato di reazione per proteasi e peptidasi
batteriche che liberano piccoli peptidi e amminoacidi (proteolisi secondaria), il cui andamento complessivo è ben rap-
presentato dai valori di NPN/Ntot%. Per entrambe le lavorazioni ed entrambe le pezzature l’andamento di questo pa-
rametro è risultato analogo a quello di NCN/Ntot%, con valori più elevati per la prima produzione, ed in particolare per
i campioni grandi prodotti con latte T6012°C.
L’analisi degli amminoacidi liberi totali (AAL), effettuata in outsourcing all’Università di Milano, ha evidenziato un au-
mento regolare del contenuto durante la stagionatura fino ai primi 4 mesi di maturazione, quando si assiste ad un ral-
lentamento probabilmente dovuto al contemporaneo aumento di fenomeni di degradazione. In generale, l’analisi non
ha evidenziato differenze sistematiche imputabili alla temperatura di conservazione del latte, ma inspiegabilmente
basso è risultato il contenuto di AAL nel campione di pezzatura grande della seconda lavorazione prodotto con latte
T60h10°/4°C, a 180 giorni di maturazione. Gli AAL presenti in maggior concentrazione relativa sono risultati acido glu-
tammico, lisina, prolina e leucina, indipendentemente dalla stagionatura. Inoltre, nel formaggio sono stati ritrovati al-
cuni AAL di neoformazione, che derivano da meccanismi metabolici di alcuni microrganismi, in seguito a reazioni di
deaminazione o decarbossilazione di alcuni degli AA liberati.
In particolare, vengono evidenziati due meccanismi riconducibili al metabolismo di alcuni microrganismi, con una ano-
malia però sempre relativa alla pezzatura grande della 2a lavorazione. Un primo processo riguarda l’acido glutammico
(GLU), che viene in parte degradato ad acido γ-aminobutirrico (GABA), con rimozione di uno ione H+, dalla glutammato-
decarbossilasi, caratteristica di alcune specie batteriche quali Lc. lactis, Lb. plantarum, Lb. brevis; la glutammina invece
si accumula e, per stagionature prolungate, viene successivamente deaminata a GLU. Un altro processo catabolico ri-
guarda la degradazione della arginina (ARG) a citrullina (CIT) e di questa a ornitina (ORN), secondo un processo degra-
dativo, noto come ADI-pathway, regolato da specifiche attività enzimatiche proprie di numerose specie batteriche che
lo utilizzano come sistema di contrasto ad una eccessiva acidificazione del mezzo (si liberano ioni ammonio), oltre che
come fonte di energia. Nei campioni della sperimentazione, sebbene con un’ampia variabilità, l’ARG totale liberata du-
rante la maturazione (quindi ARG+CIT+ORN) aumenta progressivamente (Fig. 12). A parità di pezzatura, la formazione
di ORN prevale nei formaggi ottenuti da latte T6012°C. Ciò potrebbe essere dovuto ad una selezione delle specie micro-
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