CIMURRO DEL CANE: VALUTAZIONE DEI TITOLI ANTICORPALI IN SOGGETTI CON DIVERSA ANAMNESI CLINICA E VACCINALE
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Veterinaria, Anno 13, n. 1, Febbraio 1999 31
CIMURRO DEL CANE:
VALUTAZIONE DEI TITOLI ANTICORPALI
IN SOGGETTI CON DIVERSA ANAMNESI
CLINICA E VACCINALE
ALESSANDRA SCAGLIARINI, FEDERICA BALDUCCI, ANTONIETTA DI FRANCESCO,
FABIO OSTANELLO, SANTINO PROSPERI, LUIGI MORGANTI
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Patologia Animale, Università di Bologna, Ozzano Emilia (BO)
Riassunto
Sono stati esaminati 134 sieri di cane mediante le tecniche di sieroneutralizzazione (SN), immunofluorescenza indiretta (IFI)
per IgM e IgG ed enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA-kit), al fine di valutare la risposta anticorpale nei confronti del
virus del cimurro, in animali con diversa anamnesi clinica e vaccinale. I risultati delle diverse prove sierologiche sono stati
messi a confronto per valutare il loro grado di correlazione.
Summary
134 sera, collected from dogs with different clinical and vaccination history, were tested by viral neutralisation (VN), an in-
direct immunofluorescence (IFI) to detect specific antibodies (IgM and IgG), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA-kit)
for Canine Distemper Virus. The results of the different serological tests were compared to evalutate their correlation.
INTRODUZIONE vaccinazione con virus vivo attenuato, adottata dagli anni
’50, ha contribuito a ridurre notevolmente l’incidenza
Il cimurro è una malattia infettiva, sistemica, contagio- della malattia nel cane (Appel, 1987); tuttavia, tra la fine
sa, a decorso acuto e subacuto che provoca un alto tasso degli anni ’80 e l’inizio degli anni ’90, sono state osserva-
di letalità nel cane e in altre specie. La malattia è presente te, anche in cani regolarmente vaccinati, epidemie che
in forma endemica in molte aree del mondo ad eccezione hanno coinvolto Finlandia (Ek-Kommonen e coll., 1997),
di alcune regioni aride del continente africano, in consi- Danimarca (Blinxenkrone-Moller e coll., 1993), Francia,
derazione dell’estrema sensibilità del virus alle alte tempe- Belgio ed Olanda (Adelus-Neveu e coll., 1991).
rature e alla luce solare (Appel, 1987). Il cimurro è carat- Numerosi focolai sono stati segnalati anche in Italia
terizzato clinicamente da manifestazioni a carico dell’ap- (Sagazio e coll., 1998).
parato respiratorio, gastroenterico e del sistema nervoso. Nel presente lavoro sono stati saggiati, con differenti
L’infezione, conosciuta da due secoli, è sostenuta dal metodiche sierologiche, 134 sieri di cani con diversa
Canine Distemper Virus (CDV), appartenente alla fami- anamnesi clinica e vaccinale. I titoli anticorpali ottenuti
glia Paramixoviridae genere Morbillivirus, strettamente sono stati messi a confronto allo scopo di evidenziare
correlato antigenicamente con altri virus appartenenti allo eventuali differenze tra le diverse categorie di animali
stesso genere, quali il virus della Peste bovina (RPV), del considerate, con particolare riferimento al titolo delle im-
Morbillo (MV) e il virus del Cimurro delle Foche (PDV) munoglobuline di classe M, come possibile discriminante
(Rima e coll., 1995). L’infezione raggiunge livelli di preva- di sieropositività da infezione rispetto a quella da vacci-
lenza estremamente elevati nelle popolazioni canine. La nazione.32 Cimurro del cane: valutazione dei titoli anticorpali in soggetti con diversa anamnesi clinica e vaccinale
MATERIALI E METODI no stati fissati in acetone freddo all’80% per 30 minuti.
Dopo fissazione i vetrini sono stati conservati a – 20°C fi-
Campioni esaminati no al momento dell’uso.
I sieri in esame sono stati diluiti per raddoppio, a parti-
Sono stati esaminati 134 sieri di cane, prelevati dal feb- re dalla diluizione di 1:10, in Phosphate Buffered Saline
braio 1997 al giugno 1998, appartenenti ad animali di raz- (PBS) pH 7,2 ed ogni campione saggiato è stato testato in
ze diverse, 56 dei quali di età inferiore ad 1 anno. Tutti i doppio, per la ricerca di anticorpi anti-CDV sia della clas-
soggetti provenivano dalla Regione Emilia-Romagna, ma se IgM sia della classe IgG. Come anticorpi anti-immuno-
con diversa distribuzione: 48 (35,8%) da allevamenti, 25 globuline di cane sono stati utilizzati anticorpi di capra ri-
(18,6%) da canili (e di questi 21 dal solo canile di Imola, spettivamente anti-IgM ed anti-IgG, coniugati con isotio-
BO), 10 (7,5%) da negozi di animali e 51 (38,1%) da pri- cianato di fluoresceina (KPL, UK). La lettura è stata ese-
vati. guita con microscopio a fluorescenza Leitz Diaplan, obiet-
Dei 134 soggetti esaminati, 54 (31 dei quali cuccioli) tivo 40 ×.
presentavano, al momento del prelievo, segni clinici riferi- La soglia di positività è stata fissata alla diluizione di
bili a cimurro. I restanti 80 animali sono stati presi in con- 1:20 per la ricerca di IgM e di 1:80 per la ricerca di IgG.
siderazione, sia pure in assenza di sintomatologia, in quan-
to potevano essere venuti in contatto con i soggetti sinto-
matici esaminati o nell’ambito di un controllo di routine Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
del loro stato immunitario post-vaccinale.
Relativamente al profilo vaccinale, l’anamnesi riferiva È stato utilizzato un kit del commercio (Immunocomb
che 99 cani erano stati regolarmente vaccinati con vaccini Biogal, Agrolabo To), atto all’evidenziazione di IgG anti-
a diverso numero di valenze, 27 non erano mai stati vacci- CDV. La lettura è stata eseguita su scala colorimetrica, con-
nati e 8 avevano una anamnesi vaccinale ignota. frontando la reazione sviluppata dai sieri in esame con quel-
la del siero positivo di controllo. Il dato colorimetrico è sta-
to convertito in titolo IFI, considerando come titolo soglia
Metodiche diagnostiche la diluizione di 1:80, secondo le indicazioni del produttore.
Sieroneutralizzazione (SN)
Analisi statistica
La prova di SN è stata eseguita in micrometodo, secon-
do la tecnica di Appel e Robson (1973) modificata, utiliz- Sono stati valutati: la proporzione di soggetti con sinto-
zando come substrato cellulare la linea VERO e come an- matologia riferibile a cimurro in funzione della profilassi
tigene il ceppo Onderstepoort (CDV-Ond), alla concen- vaccinale; i titoli anticorpali IgM ed IgG in funzione del
trazione d’uso di 100 TCID 50/ 50 µl. numero di valenze del vaccino utilizzato; i titoli IgM ed
I sieri in esame, preventivamente decomplementati a IgG in animali con e senza sintomi, in funzione dell’inter-
56°C per 30 minuti, sono stati diluiti per raddoppio a par- vallo di tempo tra vaccinazione e prelievo (entro 90 giorni
tire dalla diluizione di 1:10 e 50 µl di ciascuna diluizione e oltre 90 giorni). Per il confronto delle proporzioni è sta-
sono stati incubati a 37°C per 1 ora con 50 µl di sospen- to utilizzato il test chi-quadrato. Per il confronto dei titoli
sione virale. Terminata l’incubazione, in tutti i pozzetti so- anticorpali dei soggetti sieropositivi è stata valutata preli-
no stati dispensati 100 µl di cellule VERO (indice di repli- minarmente la normalità della distribuzione campionaria
cazione 5×) in Eagle MEM addizionato con 10% di siero mediante il test di Kolmogorov-Smirnov per la bontà del-
fetale bovino. In ogni piastra sono stati allestiti 8 pozzetti l’adattamento; poiché la distribuzione campionaria dei ti-
di controllo cellule e 8 pozzetti di controllo virus. La lettu- toli sierologici e dei logaritmi dei reciproci è risultata si-
ra è stata effettuata dopo 72 ore di incubazione a 37°C, gnificativamente differente da una distribuzione gaussiana
considerando come titolo neutralizzante per ciascun siero (p< 0,01), per le successive analisi statistiche sono stati im-
la più alta diluizione in grado di inibire per almeno l’80% piegati i seguenti test non parametrici: analisi della varian-
l’effetto citopatico specificatamente indotto dal virus. za non parametrica secondo Kruskall-Wallis e la U di
Come soglia di positività è stata considerata la diluizio- Mann-Whitney. Sono stati inoltre valutati i valori di corre-
ne di 1:20. lazione dei test SN, IFI per IgG e ELISA mediante il coef-
ficiente di correlazione non parametrico di Spearman. In
considerazione della scarsa numerosità della distribuzione
Immunofluorescenza indiretta (IFI) campionaria e dell’utilizzo di tecniche non parametriche, è
stato scelto un livello di significatività (α) pari a 0,01.
La reazione è stata eseguita secondo la tecnica di
Ortega-Rodriguez e coll. (1989), modificata. Per l’esecu-
zione della prova sono stati allestiti vetrini a 16 pozzetti RISULTATI
(Nunc, DK), dispensando in ciascun pozzetto 100 µl di
cellule VERO infettate con una sospensione virale di 103 I principali quadri clinici evidenziati, singoli o associati,
TCID50 /ml di CDV-Ond. I vetrini sono stati incubati a distinti per classi di età, sono riportati in Tabella 1. Segni
35°C in atmosfera al 5% di CO2; una volta raggiunto il clinici erano presenti in 21 (21,2%) dei 99 soggetti vacci-
50% di effetto citopatico, l’eccesso cellulare è stato rimos- nati e in 14 (51,9%) dei 27 cani nei quali la vaccinazione
so dai vetrini per rovesciamento ed i monostrati infetti so- non era stata eseguita (chi-quadrato = 9,93; p = 0,002). InVeterinaria, Anno 13, n. 1, Febbraio 1999 33
Tabella 1
Segni clinici evidenziati nei soggetti esaminati, divisi per classi di età
Segni clinici
nervosi respiratori oculari gastro-enterici cutanei Totale
CUCCIOLI 13 17 3 11 3 47
ADULTI 16 17 – – – 33
TOTALE 29 34 3 11 3 80
Tabella 2
Categorie di soggetti considerate
Percentuale positivi oltre soglia e media geometrica dei titoli
Categoria Vaccinati Prelievo a Sintomi Contatti a SN IFI M IFI G ELISA
rischio b % media % media % media % media
1 (n=14) No Sì - 76,9 130 92,3 130 69,2 422 69,2 219
2 (n= 8) No No No 28,6 20 75,0 24 0,0 20 0,0 40
3 (n= 5) No No Sì 80,0 70 100 92 60,0 160 60,0 139
4 (n=16) Sì 0-90 Sì - 83,3 75 87,5 88 56,3 135 57,1 198
5 (n=29) Sì 0-90 No No 76,9 149 65,5 26 55,2 101 61,5 111
6 (n= 9) Sì 0-90 No Sì 87,5 160 100 160 77,8 187 77,8 137
7 (n= 5) Sì >90 Sì - 100 254 100 279 100 485 100 422
8 (n=26) Sì >90 No No 86,4 129 84,6 35 57,7 257 53,8 115
9 (n=14) Sì >90 No Sì 100 356 100 98 100 609 100 707
a
: distanza in giorni tra vaccinazione e prelievo
b
: (-) dato non conosciuto
nessun soggetto adulto è stato rilevato interessamento cu- nizzante (gruppi 2, 5, 8), non sono emerse differenze stati-
taneo o gastroenterico. sticamente significative nei titoli anticorpali ai test SN e IFI
La valutazione comparativa dei risultati è stata effettua- per IgM e IgG e ELISA (rispettivamente: chi-quadrato =
ta in funzione delle categorie di soggetti descritte in 7,844 p = 0,020; chi-quadrato = 1,648 p = 0,439; chi-qua-
Tabella 2, nella quale vengono riportate anche le percen- drato = 7,776 p = 0,02; chi-quadrato = 1,477 p = 0,478).
tuali di soggetti che presentavano titoli anticorpali maggio- Analogamente, quando tale confronto è stato eseguito tra
ri o uguali alla soglia di positività fissata per ciascun test e soggetti senza sintomatologia, ma con possibili contatti in-
la media geometrica dei titoli riscontrati. fettanti, classificati in funzione dell’avvenuta (cat. 6, 9) o
Il confronto dei titoli anticorpali rilevati dai test SN, IFI mancata vaccinazione (cat. 3) e/o della distanza dall’ultimo
per IgM e IgG e ELISA non ha messo in evidenza diffe- intervento vaccinale, non si sono evidenziate differenze sta-
renze statisticamente significative tra soggetti non vaccina- tisticamente significative tra i titoli anticorpali ai test SN e
ti (cat. 1, 2, 3), soggetti vaccinati da meno di 90 giorni (cat. IFI per IgM e per IgG (rispettivamente: chi-quadrato =
4, 5, 6) e soggetti vaccinati da oltre 90 giorni (cat. 7, 8, 9) 4,910 p = 0,086; chi-quadrato = 3,371 p = 0,185; chi-qua-
(rispettivamente: chi-quadrato = 7,788 p = 0,020; chi-qua- drato = 6,461 p = 0,040), mentre i titoli ELISA risultano
drato = 1,262 p = 0,532; chi-quadrato = 2,189 p = 0,335; statisticamente diversi tra i 3 gruppi (chi-quadrato = 14,045
chi-quadrato = 3,561 p = 0,169). p = 0,001), con un valore più elevato nella categoria 9.
Relativamente agli aspetti clinici, non sono state rilevate Il confronto dei titoli anticorpali IgM tra i soggetti clas-
differenze statisticamente significative dei titoli anticorpali sificati in funzione della sintomatologia e dell’eventuale
ai test SN, IFI per IgM e IgG e ELISA tra i soggetti con contatto con soggetti infetti, ha evidenziato differenze sta-
sintomatologia non vaccinati (cat. 1) o vaccinati da meno di tisticamente significative tra i soggetti con sintomatologia
90 giorni (cat. 4) o oltre 90 giorni (cat. 7) (rispettivamente: rispetto ai soggetti senza sintomatologia e senza possibili
chi-quadrato = 3,636 p = 0,162; chi-quadrato = 4,249 p = contatti infettanti (rispettivamente: U = 303 p = 0,000),
0,120; chi-quadrato = 3,663 p = 0,160; chi-quadrato = con titoli sierologici più elevati nella prima categoria.
0,786 p = 0,675). Anche dal confronto tra soggetti senza Viceversa, mettendo a confronto i titoli IgM dei soggetti
sintomatologia e senza possibili contatti infettanti, classifi- sintomatici e dei soggetti senza segni clinici ma con contat-
cati in funzione dell’avvenuta o mancata vaccinazione e/o ti infettanti, non è stata evidenziata alcuna differenza stati-
della distanza intercorrente dall’ultimo trattamento immu- sticamente significativa (U = 388; p = 0,379).34 Cimurro del cane: valutazione dei titoli anticorpali in soggetti con diversa anamnesi clinica e vaccinale
È stata inoltre rilevata una differenza statisticamente si- (sino a 3 valenze antigeniche, più di 3 valenze) (rispettiva-
gnificativa dei titoli anticorpali IgM tra i soggetti asinto- mente: U = 600 p = 0,347; U = 877,5 p = 0,579; U = 815,5
matici senza contatti a rischio e i soggetti asintomatici ma p = 0,229; U = 697 p = 0,246).
con contatti a rischio (U = 185,5; p = 0,00), con un titolo Il grado di correlazione tra i risultati ELISA vs SN,
anticorpale più elevato in quest’ultima categoria. ELISA vs IFI per IgG e SN vs IFI per IgG (Figg. 1, 2,
Nessuna differenza statisticamente significativa è stata 3) sono tutti altamente significativi (rispettivamente:
evidenziata tra i titoli anticorpali ai test SN e IFI per IgM rho = 0,790 p = 0,000; rho = 0,790 p = 0,000; rho =
e IgG e ELISA in funzione del tipo di vaccino utilizzato 0,671 p = 0,000).
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
logaritmotitoloIFIperIgG
logaritmo titolo IFI per IgG
FIGURA 1 - Correlazione titoli anticorpali IFI per IgG vs ELISA (rho = 0,891; p = 0,000).
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
logaritmotitoloELISA
logaritmo titolo ELISA
FIGURA 2 - Correlazione titoli anticorpali ELISA vs SN (rho = 0,790; p = 0,000).Veterinaria, Anno 13, n. 1, Febbraio 1999 37
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
logaritmotitoloIFIperIgG
logaritmo titolo IFI per IgG
FIGURA 3 - Correlazione dei titoli anticorpali IFI per IgG vs SN (rho = 0,671; p = 0,000).
DISCUSSIONE matici e nei soggetti asintomatici che all’anamnesi denun-
ciavano contatti potenzialmente infettanti. In entrambe le
La tecnica più affidabile per la diagnosi di cimurro è categorie i titoli IgM si sono dimostrati nettamente più
certamente l’isolamento virale, ma tale metodica è difficil- elevati rispetto a quanto rilevato per i soggetti asintomatici
mente attuabile in quanto sfavorevolmente condizionata non a contatto con fonti d’infezione.
da diversi fattori, quali le difficoltà di adattamento del vi- La presenza di soggetti sintomatici e con titoli anticor-
rus selvaggio alle colture cellulari, l’estrema labilità del vi- pali al di sotto della soglia di positività in SN, IFI per
rus e la necessità nella maggior parte dei casi di utilizzare IgG ed ELISA, anche se regolarmente vaccinati, ripropo-
animali recettivi. ne il problema della mancata immunizzazione post-vacci-
Recentemente, tecniche di Reverse Tr a n s c r i p t i o n - nale (Povey, 1986; Blixenkrone-Moller e coll., 1993;
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) sono state messe a Marsilio e coll., 1996; Ek-Kommonen e coll., 1997;
punto dimostrando elevata sensibilità e specificità, ma il Sagazio e coll., 1998). Diverse sono le ipotesi finora
loro utilizzo a fini diagnostici è limitato ad alcuni laborato- avanzate per giustificare la mancata induzione immuni-
ri specializzati (Gemma e coll., 1996). taria da parte dei vaccini: a) residui dell’immunità ma-
Per tali ragioni nella diagnostica routinaria si ricorre a terna, che possono interferire con una vaccinazione
metodiche sierologiche quali sieroneutralizzazione, immu- troppo precoce; b) cattiva conservazione del vaccino; c)
nofluorescenza ed ELISA. immunodepressione dei soggetti (stress, malnutrizione,
I valori di elevata correlazione tra le tecniche SN, IFI parassitosi, trattamenti con cortisonici); d) associazione
per IgG ed ELISA, rilevati nel presente lavoro, suggeri- nel vaccino con un antigene immunodepressore quale il
scono la possibilità di un loro uguale utilizzo per quanto parvovirus (CPV).
riguarda l’evidenziazione della reattività anticorpale nei Per quanto concerne i casi da noi esaminati, le valenze
confronti del CDV. In particolare, il test ELISA da noi uti- vaccinali non sono risultate determinanti ai fini della ri-
lizzato, ha evidenziato buona correlazione con le altre pro- sposta anticorpale. La mancata reattività post-vaccinale,
ve sierologiche, come riscontrato anche da altri Autori evidenziata in una parte di soggetti, può essere attribui-
(Waner e coll., 1998) e facilità di impiego che ne consente ta, sulla base dei dati anamnestici, ad inadeguata conser-
l’uso in ambito ambulatoriale. L’utilizzo di tale test è parti- vazione del vaccino o ad interventi vaccinali troppo pre-
colarmente indicato per una valutazione dello stato immu- coci.
nitario, sia nei cuccioli in data antecedente alla prima vac-
cinazione, al fine di valutare eventuali code dell’immunità
materna, sia negli adulti come monitoraggio della risposta Ringraziamenti
anticorpale post-vaccinale.
La valutazione del titolo IgM ha dimostrato, attraverso i Si ringrazia il dott. Fulvio Marsilio (Istituto di Malattie
confronti tra le categorie esaminate, la possibile evoluzio- Infettive degli Animali “M. Compagnucci” – Università de -
ne in forma subclinica dell’infezione, in quanto sono stati gli Studi di Teramo) per avere cortesemente fornito il ceppo
rilevati titoli anticorpali sovrapponibili nei soggetti sinto- CDV-Onderstepoort.38 Cimurro del cane: valutazione dei titoli anticorpali in soggetti con diversa anamnesi clinica e vaccinale
Parole chiave
Cimurro, diagnosi sierologica, vaccinazione.
Key words
Canine distemper, serology, vaccination.
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