TaqPath COVID 19 CE IVD RT PCR Kit - ISTRUZIONI PER L'USO - Thermo Fisher ...
←
→
Trascrizione del contenuto della pagina
Se il tuo browser non visualizza correttamente la pagina, ti preghiamo di leggere il contenuto della pagina quaggiù
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit ISTRUZIONI PER L'USO Test RT-PCR real-time multiplex destinato alla rilevazione qualita‐ tiva dell’acido nucleico di SARS‑CoV‑2 Numero di catalogo A48067 Numero di pubblicazione MAN0019246 Revisione C.0 Per uso diagnostico in vitro.
Life Technologies Corporation | Life Technologies Europe B.V.
6055 Sunol Blvd | Kwartsweg 2, 2665 NN Bleiswijk
Pleasanton, CA 94566 USA The Netherlands
Per le descrizioni dei simboli sulle etichette o nella documentazione di prodotto, consultare thermofisher.com/symbols-definition.
Il cliente è responsabile del rispetto dei requisiti normativi concernenti le relative procedure e l’uso dello strumento.
Le informazioni contenute in questa guida sono soggette a modifiche senza preavviso.
ESONERO DI RESPONSABILITÀ: NELLA MISURA CONSENTITA DALLA LEGGE, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. E/O LA/E SUA/E
AFFILIATA/E NON SARANNO RESPONSABILI PER DANNI SPECIALI, INCIDENTALI, INDIRETTI, PUNITIVI, MULTIPLI O CONSEGUENTI
CONNESSI O DERIVANTI DA QUESTO DOCUMENTO, TRA CUI L'UTILIZZO DELLO STESSO.
Tradotto dalla pubblicazione in lingua inglese numero MAN0019215 Rev. F.0.
Cronologia delle revisioni: Pub. n. MAN0019215
Revisione Data Descrizione
F.0 1 marzo 2021 • Aggiunti Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software v1.5 e Applied Biosystems™
COVID‑19 Interpretive Software v2.5.
• Rimossi Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software v1.3 e Applied Biosystems™
COVID‑19 Interpretive Software v2.3.
• Aggiunte raccomandazioni di laboratorio generali.
• Aggiornati i file modello per i seguenti strumenti:
– 7500 Fast Dx Real‑Time PCR Instrument
– 7500 Fast Real‑Time PCR Instrument con SDS Software v1.5.1
• Aggiornate le istruzioni per ottenere il COVID‑19 Interpretive Software.
• Aggiunto un passaggio opzionale per rivedere la curva di amplificazione per ciascun campione nel
software COVID‑19 Interpretive Software.
• Aggiornato il testo relativo all’interpretazione dei risultati (Tabella 6 a pagina 63) e specificato che
il Ct per MS2 può essere >32 se uno qualsiasi dei target virali è positivo (Tabella 14 a pagina 71).
E.0 15 luglio 2020 • Aggiunti Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software v1.3 e Applied Biosystems™
COVID‑19 Interpretive Software v2.3.
• Rimossi Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software v1.2, Applied Biosystems™
COVID‑19 Interpretive Software v2.1 e Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software v2.2.
• Aggiunte nuove linee guida per la raccolta , la conservazione, l'imballaggio e la spedizione dei
campioni in “Limiti del saggio” a pagina 14.
• Aggiunte informazioni sul cut-off Ct (Appendice A, “Valori di cut-off Ct per i target del saggio”).
• Istruzioni aggiornate per sigillare, agitare su vortex e centrifugare le piastre per RT-PCR.
• Forniti ulteriori dettagli per la denominazione dei pozzetti di controllo negativo in piastre da 384
pozzetti con nomi univoci.
• Aggiornata la reattività (inclusività) (pagina 66).
• Aggiunte ulteriori informazioni sugli esperimenti relativi al limite di rilevamento in “Limite di
rilevamento (LoD)” a pagina 64.
D.0 2 giugno 2020 • Eliminate le istruzioni di miscelare pipettando su e giù 10 volte durante la preparazione delle
piastre RT-PCR. Aggiunte le istruzioni di agitare su vortex le piastre per 10-20 secondi per una
miscelazione appropriata.
• Aggiunte le istruzioni di aprire e richiudere una piastra di estrazione alla volta quando si preparano
le piastre RT-PCR a 384 pozzetti.
• Aggiornate le istruzioni di creare un nome univoco per ogni pozzetto nella piastra fisica, non solo
per i pozzetti con il campione di un paziente.
• Aggiunto Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR Instrument, blocco a 384 pozzetti.
• Aggiunto QuantStudio™ 5 Dx IVD Software per lo strumento Applied Biosystems™
QuantStudio™ 5 Dx Real‑Time PCR Instrument.
• Aggiunto COVID‑19 Interpretive Software v2.2.
• Aggiornati i requisiti di ripetizione dell’analisi per i campioni con risultati non conclusivi.Revisione Data Descrizione
C.0 1 maggio 2020 • Tipi di campioni aggiornati in campioni prelevati dalle vie respiratorie superiori (come campioni
nasofaringei, orofaringei, nasali e dei turbinati medi e aspirato nasofaringeo) e da lavaggio
broncoalveolare (BAL) (“Uso previsto” a pagina 8, “Limiti del saggio” a pagina 14 e “Flusso
di lavoro” a pagina 15).
• Aggiunte procedure per eseguire la RT-PCR con i seguenti strumenti: Applied Biosystems™ 7500
Real‑Time PCR Instrument, Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR Instruments
(blocco da 0,1 mL a 96 pozzetti e blocco da 0,2 mL a 96 pozzetti), Applied Biosystems™
QuantStudio™ 5 Dx Real‑Time PCR Instrument e QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR Instrument
(blocco a 384 pozzetti).
• Aggiunte nuove versioni del software: Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software v1.2 e
Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software v2.1.
• Modificato il periodo di validità del tampone TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer da 9 mesi
a 12 mesi.
• Linee guida aggiornate per l’RNA estratto (Capitolo 3, “Linee guida per l'RNA estratto dal
campione”).
• Requisiti aggiornati per i controlli basati sull'aggiunta di piastre RT-PCR real-time a 384 pozzetti
(“Linee guida per la RT-PCR” a pagina 21).
• Aggiunta di piastre di reazione senza codice a barre come opzione per RT-PCR real-time
(MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL, MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction
Plate, 0.2 mL e MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate).
• Create procedure distinte per preparare le reazioni di RT‑PCR in base al volume di campione
introdotto (≤ 200 μL o > 200 μL) e alla piastra RT-PCR (96 pozzetti o 384 pozzetti) e aggiunte
istruzioni specifiche che indicano di agitare sul vortex e centrifugare la piastra di reazione.
• Specificato che la ripetizione del test deve essere effettuata sul campione originale
(“Interpretazione dei risultati” a pagina 62).
• Requisiti aggiornati per i controlli nell’interpretazione dei risultati, basati sull’aggiunta di piastre
RT-PCR real-time a 384 pozzetti (“Interpretazione dei risultati” a pagina 62).
• Aggiunta la sezione “Sostanze interferenti” a pagina 66.
• Rimossi i riferimenti a COVID‑19 Interpretive Software v1.1.
B.0 27 marzo 2020 • Correzione della descrizione di MS2 Phage Control in “Descrizione del prodotto” da “DNA di
controllo” a “RNA di controllo”.
• Ampliamento della descrizione delle informazioni relative ad assistenza e supporto tecnico
disponibili su https://www.thermofisher.com/contactus in “Assistenza clienti e supporto
tecnico”.
• Modificato il periodo di validità del tampone TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer.
A.0 24 marzo 2020 Nuovo documento.
Importanti informazioni sulla licenza: Questo prodotto può essere coperto da una o più licenze con limitazioni d'uso. Con l'utilizzo di
questo prodotto, si accettano i termini e le condizioni di tutte le licenze con limitazioni d’uso applicabili.
MARCHI COMMERCIALI: Tutti i marchi sono di proprietà di Thermo Fisher Scientific e delle sue filiali, se non diversamente specificato.
Nasacort è un marchio commerciale di AVENTISUB LLC. Dymista è un marchio commerciale di Meda Pharmaceuticals Inc. NeilMed
e Nasogel sono marchi commerciali di NeilMed Products, Inc. Chloraseptic è un marchio commerciale di Medtech Products Inc.
Bactroban è un marchio commerciale di GLAXOSMITHKLINE LLC. Similasan è un marchio commerciale di Similasan AG Corporation
Switzerland.
©2020 Thermo Fisher Scientific Inc. Tutti i diritti riservati.Contenuto
■ CAPITOLO 1 Informazioni sul prodotto TaqPath COVID‑19 CE‑IVD
™
RT‑PCR Kit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Descrizione del prodotto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Contenuto e conservazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Compatibilità del software e dello strumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Raccomandazioni generali di laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Limiti del saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Campioni e controlli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Flusso di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
■ CAPITOLO 2 Prima di cominciare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Avvertenze e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
■ CAPITOLO 3 Linee guida per l'RNA estratto dal campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Volumi di campione introdotto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Linee guida per l’estrazione dell’RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Aggiunta di MS2 Phage Control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
■ CAPITOLO 4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Linee guida per la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL,
piastra di reazione a 96 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL,
piastra di reazione a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto >200 µL,
piastra di reazione a 96 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto >200 µL,
piastra di reazione a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoContenuto
■ CAPITOLO 5 Esecuzione della RT-PCR usando lo strumento Applied
™
Biosystems 7500 Fast Dx Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Calibrazione del colorante per la serie 7500 Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . 32
Trasferimento del file modello (SDT) per lo strumento 7500 Fast Dx Real‑Time
PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Configurazione e utilizzo dello strumento 7500 Fast Dx Real‑Time PCR Instrument . . . . . 33
■ CAPITOLO 6 Esecuzione della RT-PCR usando lo strumento Applied
™
Biosystems 7500 Fast Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Calibrazione del colorante per la serie 7500 Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . 35
Trasferimento del file modello (SDT o EDT) per lo strumento 7500 Fast Real‑Time
PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Configurazione e utilizzo dello strumento 7500 Fast Real‑Time PCR Instrument
(software SDS Software v1.5.1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Configurazione e utilizzo dello strumento 7500 Fast Real‑Time PCR Instrument
(software 7500 Software v2.3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
■ CAPITOLO 7 Esecuzione della RT-PCR usando lo strumento Applied
™
Biosystems 7500 Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Calibrazione del colorante per la serie 7500 Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . 41
Trasferimento del file modello (EDT) per lo strumento 7500 Real‑Time PCR Instrument . . 42
Configurazione e utilizzo dello strumento 7500 Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . 42
■ CAPITOLO 8 Esecuzione della RT-PCR usando lo strumento Applied
™ ™
Biosystems QuantStudio 5 Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
™
Calibrazione del colorante per QuantStudio 5 Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . 45
™
Trasferimento del file modello (EDT) per lo strumento QuantStudio 5 Real‑Time
PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
™
Configurazione e utilizzo dello strumento QuantStudio 5 Real‑Time PCR
Instrument (piastre a 96 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
™
Configurazione e utilizzo dello strumento QuantStudio 5 Real‑Time PCR
Instrument (piastre a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 5Contenuto
■ CAPITOLO 9 Esecuzione della RT-PCR usando lo strumento Applied
™ ™
Biosystems QuantStudio 5 Dx Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . . . . . . . . 51
™
Calibrazione del colorante per QuantStudio 5 Dx Real‑Time PCR Instrument . . . . . . . . . 51
™
QuantStudio 5 Dx TD Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
™
Trasferimento del file modello (EDT) per lo strumento QuantStudio 5 Dx
™
Real‑Time PCR Instrument (QuantStudio 5 Dx TD Software ) . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
™
Configurazione e utilizzo dello strumento QuantStudio 5 Dx Real‑Time PCR
™
Instrument (QuantStudio 5 Dx TD Software ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
™
QuantStudio 5 Dx IVD Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
™
Trasferimento del file modello (EDT) per lo strumento QuantStudio 5 Dx
™
Real‑Time PCR Instrument (QuantStudio 5 Dx IVD Software ) . . . . . . . . . . . . . . . . 55
™
Installazione di un file modello in QuantStudio 5 Dx IVD Software . . . . . . . . . . . . . . 55
™
Configurazione e utilizzo dello strumento QuantStudio 5 Dx Real‑Time PCR
™
Instrument (QuantStudio 5 Dx IVD Software ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
■ CAPITOLO 10 Esecuzione della RT-PCR utilizzando lo strumento
™ ™
Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR Instrument
(blocco a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
™
Calibrazione del colorante per QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR Instrument . . . . . . . . 57
™
Trasferimento del file modello (EDT) per lo strumento QuantStudio 7 Flex Real-
Time PCR Instrument (blocco a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
™
Configurazione e utilizzo dello strumento QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR
Instrument (blocco a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
■ CAPITOLO 11 Analisi e risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
™
Ottenimento del software Applied Biosystems COVID‑19 Interpretive Software . . . . . . . 61
Analisi dei dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Interpretazione dei risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
■ CAPITOLO 12 Caratteristiche prestazionali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Limite di rilevamento (LoD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Reattività (Inclusività) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Sostanze interferenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Reattività crociata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Valutazione clinica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
6 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoContenuto
■ APPENDICE A Valori di cut-off Ct per i target del saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
■ APPENDICE B Documentazione e supporto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Documentazione correlata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Assistenza clienti e supporto tecnico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
Garanzia limitata del prodotto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 71 Informazioni sul prodotto TaqPath™
COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
Uso previsto
Il kit TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit contiene i reagenti e i controlli per un test di reazione a
catena della polimerasi con trascrizione inversa real-time (RT-PCR) destinato alla rilevazione qualitativa
dell'acido nucleico di SARS-CoV-2 in campioni prelevati dalle vie aeree superiori (ad esempio tamponi
nasofaringei, orofaringei, nasali e dei turbinati medi e aspirato nasofaringeo) e lavaggio broncoalveolare
(BAL), ottenuti da soggetti con sospetta COVID-19.
I risultati servono per l’identificazione dell’RNA di SARS-CoV-2. In genere, l’RNA di SARS-CoV-2 è
rilevabile in campioni ottenuti dalle vie respiratorie superiori e lavaggio broncoalveolare (BAL) durante
la fase acuta dell’infezione. I risultati positivi indicano la presenza dell’RNA di SARS-CoV-2; per
determinare lo stato di infezione del paziente è necessaria una correlazione clinica con l'anamnesi dello
stesso e con altre informazioni diagnostiche. I risultati positivi non escludono un’infezione batterica o
una co-infezione con altri virus. L’agente rilevato potrebbe non essere la causa certa della malattia.
Ai laboratori può essere chiesto di segnalare tutti i risultati positivi alle appropriate autorità sanitarie
competenti.
I risultati negativi non precludono un’infezione da SARS-CoV-2 e le decisioni relative alla gestione dei
pazienti non devono basarsi esclusivamente su di essi. I risultati negativi devono essere combinati con
osservazioni cliniche, anamnesi del paziente e informazioni epidemiologiche.
Il kit TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit è destinato all’uso da parte di personale di laboratorio
clinico appositamente istruito e addestrato alle tecniche di PCR real-time e alle procedure diagnostiche
in vitro.
Nota: I seguenti Paesi richiedono che i prodotti diagnostici in vitro siano dotati di marchio CE:
Austria, Belgio, Bulgaria, Cipro, Croazia, Danimarca, Estonia, Finlandia, Francia, Germania, Grecia,
Irlanda, Italia, Lettonia, Lituania, Lussemburgo, Malta, Paesi Bassi, Polonia, Portogallo, Repubblica
Ceca, Romania, Slovacchia, Slovenia, Spagna, Svezia, Ungheria, Regno Unito, Norvegia, Islanda,
Liechtenstein, Svizzera, Turchia.
8 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoCapitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
Descrizione del prodotto 1
Descrizione del prodotto
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit include i seguenti componenti:
• TaqPath™ COVID‑19 RT‑PCR Kit, 1000 reazioni
– TaqPath™ COVID‑19 Assay Multiplex—Saggi multiplex che contengono tre set di primer/sonde
specifici per diverse regioni del genoma di SARS-CoV-2 e primer/sonde per il batteriofago
MS2.
– MS2 Phage Control—RNA di controllo per verificare l’efficacia della preparazione del campione
e l’assenza di inibitori nella reazione di PCR. Per eseguire il controllo, aggiungere MS2 Phage
Control ai campioni prima di estrarre l’RNA.
• TaqPath™ COVID‑19 Control—RNA di controllo che contiene target specifici per le regioni del
genoma di SARS-CoV-2 obiettivo dei saggi.
• TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer
• TaqPath™ 1‑Step Multiplex Master Mix (No ROX™)
• Foglio illustrativo—Fornisce le istruzioni e il collegamento per scaricare le Istruzioni per l’uso.
Contenuto e conservazione
Tabella 1 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit, 1.000 reazioni (n. di cat. A48067)
Volume per
Numero di Conserva‐ Periodo di
Componente Contenuto Quantità provetta o
codice zione validità[1]
flacone
TaqPath™ COVID‑19
Assay Multiplex
1.500 µL da –30 °C
(Gene ORF1ab, N 1 provetta 100093311 12 mesi
™
TaqPath COVID‑19 (1.000 reazioni) a –10 °C
Protein, S Protein,
RT‑PCR Kit MS2)
10 pro‐ da –30 °C
MS2 Phage Control 1 mL 100093312 12 mesi
vette a –10 °C
10 µL
10 pro‐
TaqPath™ COVID‑19 Control (1 x 104 copie / 100093314 ≤ –70 °C 12 mesi
vette
μL)
10 pro‐ da –30 °C
TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer 250 µL 100093291 12 mesi
vette a –10 °C
TaqPath™ 1‑Step Multiplex Master Mix (No da –30 °C
1 flacone 10 mL A48111 12 mesi
ROX™) a –10 °C
[1] Il periodo di validità del kit è pari a quello del componente del kit con periodo di validità più breve.
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 9Capitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
1 Materiali richiesti ma non forniti
Materiali richiesti ma non forniti
Se non diversamente indicato, tutti i materiali sono disponibili su thermofisher.com. "MLS" indica che
il materiale è disponibile presso fisherscientific.com o un altro principale fornitore di materiale da
laboratorio.
Articolo Fonte
Strumento di PCR real-time
Applied Biosystems™ 7500 Fast Dx Real‑Time PCR Instrument 4406984 (con computer laptop)
(usato con SDS Software v1.4.1) 4406985 (con computer tower)
Applied Biosystems™ 7500 Fast Real‑Time PCR Instrument 4351106 (con computer laptop)
(usato con SDS Software v1.5.1 o 7500 Software v2.3) 4351107 (con computer desktop)
Applied Biosystems™ 7500 Real‑Time PCR Instrument 4351104 (con computer laptop)
(usato con 7500 Software v2.3) 4351105 (con computer desktop)
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR A28569 (con computer laptop)
Instrument, blocco da 0,2 mL
A28574 (con computer desktop)
(usato con QuantStudio™ Design and Analysis Desktop
Software v1.5.1) A28139 (solo strumento)
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR A28568 (con computer laptop)
Instrument, blocco da 0,1 mL
A28573 (con computer desktop)
(usato con QuantStudio™ Design and Analysis Desktop
Software v1.5.1) A28138 (solo strumento)
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR A28570 (con computer laptop)
Instrument, blocco a 384 pozzetti
A28575 (con computer desktop)
(usato con QuantStudio™ Design and Analysis Desktop
Software v1.5.1) A28140 (solo strumento)
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Dx Real‑Time PCR
Instrument A32005 (con computer laptop)
(usato con QuantStudio™ 5 Dx TD Software v1.0.2
o A32006 (con computer tower)
QuantStudio™ 5 Dx IVD Software v1.0.2)
Applied Biosystems™ QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR 4485695 (con computer laptop)
Instrument, blocco a 384 pozzetti
(usato con QuantStudio™ Real‑Time PCR Software v1.3) 4485701 (con computer desktop)
Apparecchiature
Congelatori per laboratorio
• Da -30 °C a -10 °C MLS
• ≤ –70 °C
Centrifuga, con un rotore per micropiastre MLS
10 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoCapitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
Materiali richiesti ma non forniti 1
(continua)
Articolo Fonte
Microcentrifuga MLS
Mixer da laboratorio, vortex o equivalente MLS
Pipettatori regolabili, a canale singolo o multiplo (da 1,00 µL a
MLS
1.000,0 µL)
Blocco freddo (96 pozzetti o 384 pozzetti) o ghiaccio MLS
Kit e reagenti
Nuclease-free Water (not DEPC-Treated) MLS
Piastre di calibrazione (serie 7500 Real‑Time PCR Instrument)
ABY™ Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast
A24734
96-well (0,1 mL)
JUN™ Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast
A24735
96-well (0,1 mL)
ABY™ Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR,
A24738
96‑well (0,2 mL)
JUN™ Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 96-
A24737
well (0,2 mL)
Piastre di calibrazione (QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR Instrument)
ABY™ Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR,
A24736
384‑well
JUN™ Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 384-
A24733
well
Provette, piastre e altri materiali di consumo
MicroAmp™ Fast Optical 96‑Well Reaction Plate with Barcode,
4346906, 4366932
0.1 mL
MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL 4346907
MicroAmp™ Optical 96‑Well Reaction Plate with Barcode,
4306737, 4326659
0.2 mL
MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate, 0.2 mL N8010560, 4316813
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode 4309849, 4326270, 4343814
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate 4343370
MicroAmp™ Optical Adhesive Film 4311971, 4360954
MicroAmp™ Adhesive Film Applicator 4333183
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 11Capitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
1 Compatibilità del software e dello strumento
(continua)
Articolo Fonte
Provette antiaderenti per microcentrifuga, prive di RNasi (da
thermofisher.com/plastics
1,5 mL e 2,0 mL)
Puntali sterili per pipette con barriera aerosol (filtro) thermofisher.com/pipettetips
Compatibilità del software e dello strumento
La tabella seguente indica la versione del software Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive
Software che è compatibile con lo strumento e il software di analisi associato.
Per informazioni su come ottenere il software Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software,
vedere “Ottenimento del software Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive Software” a pagina 61.
Per ottenere il software o il firmware di analisi da utilizzare con il proprio strumento di PCR real-time,
andare a thermofisher.com/qpcrsoftware, quindi selezionare il proprio strumento nella sezione Real-
Time PCR (PCR real-time).
Versione compatibile del
Software di analisi usato con lo
Strumento software COVID‑19 Interpretive
strumento
Software
7500 Fast Dx Real‑Time PCR Instrument SDS Software v1.4.1 v1.5
SDS Software v1.5.1
7500 Fast Real‑Time PCR Instrument oppure v1.5
7500 Software v2.3
7500 Real‑Time PCR Instrument 7500 Software v2.3 v1.5
QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR Instrument
con firmware dello strumento v1.3.3
QuantStudio™ Design and
v2.5
Blocco da 0,2 mL a 96 pozzetti Analysis Desktop Software v1.5.1
Blocco da 0,1 mL a 96 pozzetti
QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR Instrument
con firmware dello strumento v1.3.3 QuantStudio™ Design and
v2.5
Analysis Desktop Software v1.5.1
Blocco a 384 pozzetti
QuantStudio™ 5 Dx Real‑Time PCR
QuantStudio™ 5 Dx TD Software
Instrument con firmware dello strumento v2.5
v1.0.2
v1.0.3
12 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoCapitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
Raccomandazioni generali di laboratorio 1
(continua)
Versione compatibile del
Software di analisi usato con lo
Strumento software COVID‑19 Interpretive
strumento
Software
QuantStudio™ 5 Dx Real‑Time PCR
QuantStudio™ 5 Dx IVD Software
Instrument con firmware dello strumento v2.5
v1.0.2
v1.0.3
QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR
Instrument con firmware dello strumento QuantStudio™ Real‑Time PCR
v1.0.4 v2.5
Software v1.3
Blocco a 384 pozzetti
Raccomandazioni generali di laboratorio
• Per prevenire la contaminazione, implementare nel proprio laboratorio procedure operative
standard quali le seguenti:
– Cambi frequenti dei guanti
– Decontaminazione frequente di superfici, apparecchiature e pipette con una soluzione di
decontaminazione o candeggina al 10%, seguita da etanolo al 70%
– Uso di luce ultravioletta durante la decontaminazione della cappa di sicurezza biologica
(quando disponibile)
• Per prevenire la degradazione, durante l'uso conservare l'RNA del campione eluito, le miscele
master, i saggi e i controlli su ghiaccio o in blocchi freddi.
• Limitare i cicli di congelamento-scongelamento.
• Suddividere i reagenti in aliquote per prevenire la contaminazione della soluzione madre e ridurre il
numero di cicli di congelamento-scongelamento.
• Dopo ogni analisi, esaminare le curve di amplificazione con il software interpretativo per identificare
segni di agitazione o centrifugazione non adeguata. Contattare l'assistenza per le applicazioni per
ottenere maggiori informazioni o una formazione sul QC dei dati nel software dello strumento.
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 13Capitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
1 Limiti del saggio
Limiti del saggio
• Questo saggio è destinato esclusivamente all’uso per scopi diagnostici in vitro. Osservare le buone
pratiche di laboratorio, nonché tutte le precauzioni e le linee guida indicate nelle presenti guide per
l’utilizzatore, al fine di evitare la contaminazione crociata tra i campioni.
• Le prestazioni del kit TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit sono state determinate usando
esclusivamente campioni di tampone nasofaringeo e orofaringeo, aspirato nasofaringeo e lavaggio
broncoalveolare. Tamponi nasali e dei turbinati medi sono considerati tipi di campione accettabili
secondo l’Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from
Persons for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) pubblicato dai Center for Disease Control and
Prevention, ma le prestazioni del kit TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit con questi tipi di
campioni non sono state stabilite. Test di tamponi nasali e dei turbinati medi (auto-prelevati sotto
supervisione di un operatore sanitario o prelevati da un operatore sanitario) sono limitati a pazienti
con sintomi di COVID-19. Tipi di campioni diversi dai tamponi nasofaringei, orofaringei, nasali e
dei turbinati medi, aspirato nasofaringeo e lavaggio broncoalveolare non devono essere testati con
questo saggio.
• I campioni devono essere raccolti, trasportati e conservati utilizzando le procedure e le condizioni
appropriate. Se la raccolta, il trasporto o la conservazione dei campioni avvengono in modo
scorretto, la capacità del saggio di rilevare le sequenze target può essere compromessa.
• Per le linee guida sulla raccolta e la conservazione dei campioni, fare riferimento a Interim
Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens from Persons for Coronavirus
Disease 2019 (COVID-19), pubblicato dai Centers for Disease Control and Prevention.
• I campioni devono essere imballati, spediti e trasportati secondo l'edizione attuale del regolamento
sulle merci pericolose dell’associazione per il trasporto aereo internazionale (International Air
Transport Association, IATA) (iata.org/en/programs/cargo/dgr).
• Questo kit utilizza RNA purificato come campione da analizzare. La qualità dell’RNA ottenuto dai
campioni biologici è essenziale per la qualità dei risultati generati con questo kit.
• Risultati falsi negativi possono derivare da:
– Raccolta scorretta dei campioni
– Degradazione dell’RNA virale durante la spedizione/conservazione
– Raccolta del campione quando l'acido nucleico non può più essere trovato nella matrice del
campione
– Uso di un metodo di estrazione di scarsa efficacia
– Presenza di inibitori della RT-PCR
– Mutazione del virus SARS-CoV-2
– Mancata ottemperanza alle istruzioni per l’uso
• Risultati falsi positivi possono derivare da:
– Contaminazione crociata durante la manipolazione o la preparazione dei campioni
– Contaminazione crociata tra i campioni dei pazienti
– Scambio dei campioni
– Contaminazione dell’RNA durante la manipolazione dei prodotti
• L’effetto di vaccini, farmaci antivirali, antibiotici, chemioterapici o immunosoppressori non è stato
valutato. Il kit TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit non può escludere malattie causate da altri
patogeni batterici o virali.
14 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoCapitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
Campioni e controlli 1
• I risultati negativi non precludono un’infezione da virus SARS-CoV-2 e le decisioni relative alla
gestione dei pazienti non devono basarsi esclusivamente su di essi.
• Ai laboratori può essere chiesto di segnalare tutti i risultati positivi alle appropriate autorità sanitarie
competenti.
Campioni e controlli
I campioni dei pazienti devono essere raccolti seguendo le linee guida appropriate del laboratorio. Per
interpretare accuratamente i risultati dei pazienti devono essere inclusi controlli positivi e negativi.
Includere i seguenti controlli:
Controllo Usato per monitorare Saggi
Controllo positivo (TaqPath™ Impostazione della reazione di RT‑PCR e Tutti e tre i saggi per
COVID‑19 Control Kit) integrità dei reagenti SARS-CoV-2
Estrazione dell’RNA e assenza di inibitori
MS2 Phage Control Saggio per MS2
nella reazione di qPCR
Contaminazione crociata durante Tutti e tre i saggi per
Controllo negativo l'estrazione dell’RNA e impostazione della SARS-CoV-2
reazione Saggio per MS2
Flusso di lavoro
Il flusso di lavoro inizia con la purificazione dell'acido nucleico da campioni prelevati dalle vie
aeree superiori (ad esempio tamponi nasofaringei, orofaringei, nasali e dei turbinati medi e aspirato
nasofaringeo) e da lavaggio broncoalveolare (BAL).
L'acido nucleico purificato viene sottoposto a trascrizione inversa in cDNA e amplificato usando il kit
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit e uno dei seguenti strumenti per PCR real-time:
• Applied Biosystems™ 7500 Fast Dx Real‑Time PCR instrument
• Applied Biosystems™ 7500 Fast Real‑Time PCR Instrument
• Applied Biosystems™ 7500 Real‑Time PCR Instrument
• Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR Instrument, blocco da 0,2 mL a 96 pozzetti
• Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR Instrument, blocco da 0,1 mL a 96 pozzetti
• Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR Instrument, blocco a 384 pozzetti
• Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Dx Real‑Time PCR Instrument
• Applied Biosystems™ QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR Instrument, blocco a 384 pozzetti
Durante il processo, le sonde si appaiano a tre (3) sequenze target specifiche per SARS-CoV-2. Ogni
target è situato tra primer forward e reverse esclusivi per i seguenti geni:
• ORF1ab
• Proteina N
• Proteina S
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 15Capitolo 1 Informazioni sul prodotto TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit
1 Flusso di lavoro
Durante la fase di estensione del ciclo di PCR, l'attività 5’ nucleasica della Taq polimerasi degrada la
sonda. Questa degradazione causa la separazione del colorante reporter dal colorante quencher, il che
genera un segnale fluorescente. Ad ogni ciclo, ulteriori molecole di colorante reporter vengono scisse
dalle rispettive sonde, cosa che aumenta l’intensità della fluorescenza. L’intensità della fluorescenza
viene monitorata a ogni ciclo di PCR dallo strumento di PCR real-time.
I dati vengono analizzati e interpretati dal software Applied Biosystems™ COVID‑19 Interpretive
Software.
16 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso2 Prima di cominciare
Avvertenze e precauzioni
Il flusso di lavoro del kit TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit deve essere eseguito da personale
qualificato e addestrato per evitare il rischio di risultati errati. Utilizzare zone distinte per la preparazione
dei campioni dei pazienti e dei controlli per prevenire risultati falsi positivi. I campioni e i reagenti
devono essere maneggiati sotto cappa a flusso d'aria laminare o cappa di sicurezza biologica.
• I campioni devono sempre essere trattati come infettivi e/o a rischio biologico in conformità con le
procedure di sicurezza del laboratorio.
• Seguire le precauzioni necessarie quando si manipolano i campioni. Utilizzare dispositivi di
protezione individuale (DPI) coerenti con le linee guida vigenti per la manipolazione di campioni
potenzialmente infettivi.
• Utilizzare sempre puntali per pipette con barriere aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili e
privi di DNasi e RNasi.
• Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle zone di lavoro.
• Le modifiche ai reagenti del saggio, al protocollo del saggio o alla strumentazione non sono
permesse e violano la direttiva sui dispositivi medico-diagnostici in vitro 98/79/CE.
• Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.
• Smaltire i rifiuti in conformità con i regolamenti locali.
• Le schede di dati di sicurezza sono disponibili su richiesta.
• Ai laboratori può essere chiesto di segnalare tutti i risultati positivi alle appropriate autorità sanitarie
competenti.
I seguenti Paesi richiedono che i prodotti diagnostici in vitro siano dotati di marchio CE:
Austria, Belgio, Bulgaria, Cipro, Croazia, Danimarca, Estonia, Finlandia, Francia, Germania, Grecia,
Irlanda, Italia, Lettonia, Lituania, Lussemburgo, Malta, Paesi Bassi, Polonia, Portogallo, Repubblica
Ceca, Romania, Slovacchia, Slovenia, Spagna, Svezia, Ungheria, Regno Unito, Norvegia, Islanda,
Liechtenstein, Svizzera, Turchia.
• I risultati positivi indicano la presenza dell’RNA di SARS‑CoV-2.
• Maneggiare tutti i campioni e i controlli come se potessero trasmettere agenti infettivi.
• I reagenti devono essere conservati e maneggiati come indicato nella Tabella 1.
• La qualità della preparazione dei campioni (RNA purificato) può influenzare la qualità del test qPCR.
I laboratori devono usare esclusivamente il metodo di purificazione che hanno scelto. I laboratori
che non hanno scelto alcun metodo possono usare il kit MagMAX™ Viral/Pathogen Nucleic Acid
Isolation Kit o il kit MagMAX™ Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation Kit.
• Il kit per qPCR include un RNA phage control per verificare l’efficacia della preparazione del
campione e l’assenza di inibitori nella reazione di PCR. Per eseguire il controllo, aggiungere MS2
Phage Control ai campioni prima di estrarre l’RNA, in base alle indicazioni fornite in Capitolo 3,
“Linee guida per l'RNA estratto dal campione”.
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 17Capitolo 2 Prima di cominciare
2 Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni
Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni
Nota: Maneggiare tutti i campioni e i controlli come se potessero trasmettere agenti infettivi.
18 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso3 Linee guida per l'RNA estratto dal
campione
Volumi di campione introdotto
Per soddisfare la necessità di un'ampia gamma di volumi di campione introdotto, vengono forniti 2
protocolli per RT-PCR, a seconda del volume di campione introdotto.
Sono stati testati i seguenti volumi di campione introdotto:
• Basso volume introdotto: 200 µL
• Alto volume introdotto: 400 µL
Non sono stati testati volumi di campione introdotto > 400 µL con TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR
Kit.
Sono stati testati i seguenti kit di estrazione dell'RNA:
• MagMAX™ Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit
• MagMAX™ Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation Kit
Linee guida per l’estrazione dell’RNA
L'RNA estratto può essere preparato con qualsiasi procedura standard di estrazione dell’RNA o kit di
estrazione dell'RNA. Il volume minimo di eluizione consigliato è di 50 µL.
Le seguenti linee guida sono definite come ottimali per l'utilizzo del kit TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD
RT‑PCR Kit.
• Il controllo MS2 Phage Control fornito nel kit deve essere usato per verificare l’efficacia della
preparazione del campione e l’assenza di inibitori nella reazione di RT-PCR. Viene aggiunto al
campione prima dell'estrazione (vedere “Aggiunta di MS2 Phage Control” a pagina 20).
• Usare Nuclease-free Water (not DEPC-Treated) contenente MS2 Phage Control come controllo
negativo. Il controllo negativo purificato è usato come controllo negativo per la RT-PCR.
• Si consiglia un volume di MS2 Phage Control pari al 2,5% del volume del campione introdotto.
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 19Capitolo 3 Linee guida per l'RNA estratto dal campione
3 Aggiunta di MS2 Phage Control
Aggiunta di MS2 Phage Control
Il controllo MS2 Phage Control deve essere usato per verificare l’efficacia della preparazione del
campione e l’assenza di inibitori nella reazione di RT-PCR.
Aggiungere un volume di MS2 Phage Control appropriato a ogni pozzetto del campione e al pozzetto
del controllo negativo subito prima della lisi durante l’estrazione dell’RNA.
Si consiglia un volume di MS2 Phage Control pari al 2,5% del volume del campione introdotto. Esempi
sono riportati nella tabella seguente:
Volume di campione introdotto Volume di MS2 Phage Control
200 µL 5 µL di MS2 Phage Control
400 µL 10 µL di MS2 Phage Control
20 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso4 Preparazione delle reazioni di
RT‑PCR
■ Linee guida per la RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
■ Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL, piastra
di reazione a 96 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
■ Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL, piastra
di reazione a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
■ Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto >200 µL, piastra
di reazione a 96 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
■ Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto >200 µL, piastra
di reazione a 384 pozzetti) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Nota: Il procedimento usato per preparare le reazioni di RT-PCR dipende dal volume del campione
originale introdotto usato durante la preparazione dell’RNA (≤ 200 µL o > 200 µL). Il procedimento usato
per preparare le reazioni di RT-PCR dipende anche dal fatto che per l’RT-PCR venga utilizzata una
piastra a 96 pozzetti o a 384 pozzetti.
Linee guida per la RT-PCR
IMPORTANTE!
· Per ogni piastra di reazione RT-PCR, includere i seguenti controlli:
· Un controllo positivo
· Un controllo negativo per ogni estrazione.
Ad esempio, se su una piastra di reazione RT-PCR a 384 pozzetti vengono combinati i campioni di
RNA ottenuti da 4 estrazioni, su tale piastra di reazione a 384 pozzetti devono essere analizzati 4
pozzetti di controllo negativo.
· Preparare la piastra di reazione RT-PCR su ghiaccio e tenerla su ghiaccio finché non viene caricata
sullo strumento di PCR real-time.
· Analizzare la piastra subito dopo averla preparata. In caso contrario, i campioni di RNA potrebbero
degradarsi.
· Per impedire la contaminazione, preparare i reagenti in una stazione di lavoro per PCR o in un’area
equivalente priva di ampliconi. Non utilizzare la stessa pipetta per controlli e campioni di RNA e
utilizzare sempre puntali per pipette con barriera aerosol.
· Mantenere l’ambiente privo di RNasi.
· Proteggere i saggi dalla luce.
· Conservare i campioni di RNA e i componenti su ghiaccio durante l’uso.
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 21Capitolo 4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR
4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL, piastra di reazione a 96 pozzetti)
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del
campione introdotto ≤200 µL, piastra di reazione a 96
pozzetti)
Utilizzare questa procedura nelle seguenti condizioni:
• Per l’estrazione è stato utilizzato un volume del campione introdotto originale fino a 200 µL
• Lo strumento è compatibile con le piastre di reazione RT-PCR a 96 pozzetti
1. Se congelati, scongelare i reagenti su ghiaccio.
2. Agitare delicatamente su vortex i reagenti, quindi centrifugarli brevemente per raccogliere il liquido
sul fondo della provetta.
3. Diluire TaqPath™ COVID‑19 Control (1 × 104 copie/µL) fino a ottenere una soluzione madre di 25
copie/µL:
a. Pipettare 98 µL di TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer in una provetta per
microcentrifuga, quindi aggiungere 2 µL di TaqPath™ COVID‑19 Control. Mescolare bene,
quindi centrifugare brevemente.
b. Pipettare 87,5 µL di TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer in una seconda provetta per
microcentrifuga, quindi aggiungere 12,5 µL della soluzione creata al passaggio intermedio 3a.
Mescolare bene, quindi centrifugare brevemente.
Nota: TaqPath™ COVID‑19 Control non contiene l'MS2 template.
4. Preparare la miscela di reazione:
a. Per ogni corsa, combinare i seguenti componenti in quantità sufficiente per il numero di
campioni di RNA da testare, più un controllo positivo e un controllo negativo.
Tutti i volumi includono un eccesso del 10% per errori di pipettaggio.
IMPORTANTE! I volumi riportati in questa tabella presuppongono che il campione di RNA sia
stato estratto usando un volume del campione introdotto originale di fino a 200 µL.
Volume per campione di Volume per n campioni di Volume per 94 campioni di
Componente
RNA o controllo RNA più 2 controlli RNA più 2 controlli
TaqPath™ 1‑Step Multiplex
6,25 µL 6,875 x (n + 2) µL 660 µL
Master Mix (No ROX™) (4X)
COVID-19 Real Time PCR
1,25 µL 1,375 x (n + 2) µL 132 µL
Assay Multiplex
Nuclease-free Water 7,50 µL 8,25 x (n + 2) µL 792 µL
Volume totale della
15,0 µL — 1584 µL
miscela di reazione
22 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoCapitolo 4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL, piastra di reazione a 96 pozzetti) 4
5. Impostare la piastra di reazione:
a. Pipettare 15,0 µL della miscela di reazione preparata al passaggio 4 in ogni pozzetto di una
MicroAmp™ Fast Optical 96‑Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL o una MicroAmp™
Optical 96‑Well Reaction Plate with Barcode, 0.2 mL.
Si possono usare piastre senza codice a barre (vedere “Materiali richiesti ma non forniti” a
pagina 10).
b. Agitare delicatamente su vortex la piastra sigillata contenente il campione purificato di
RNA e il controllo negativo ottenuti nella procedura di estrazione dell'RNA, poi centrifugare
brevemente per raccogliere il liquido sul fondo della piastra.
c. Aprire la piastra contenente il campione di RNA purificato e il controllo negativo ottenuti
nella procedura di estrazione dell’RNA. Aggiungere l’RNA del campione, il controllo negativo
o il controllo positivo a ciascun pozzetto della piastra di reazione in base alla Tabella 2 a
pagina 24.
d. Sigillare accuratamente la piastra con MicroAmp™ Optical Adhesive Film.
IMPORTANTE! Quando si applica il MicroAmp™ Optical Adhesive Film, assicurarsi che la
pressione sia applicata su tutta la piastra e che la sigillatura sia ermetica su ogni singolo
pozzetto. In caso contrario, si corre il rischio che un pozzetto sia sigillato in modo errato, con
conseguente potenziale contaminazione tra un pozzetto e l’altro durante l’agitazione su vortex
ed evaporazione durante la PCR.
e. Agitare su vortex la piastra alla massima impostazione di velocità per 10-30 secondi con
pressione media. Spostare in più punti la piastra per garantire un contatto uniforme sulla
piattaforma dell’agitatore vortex.
IMPORTANTE! Agitare su vortex per 10-30 secondi per una miscelazione appropriata. In
caso contrario, si potrebbe verificare una falsa classificazione dei campioni.
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 23Capitolo 4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR
4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL, piastra di reazione a 384 pozzetti)
f. Centrifugare la piastra di reazione per 1-2 minuti a ≥650 × g (≥650 RCF) per rimuovere le bolle
e raccogliere il liquido sul fondo della piastra di reazione.
Tabella 2 Volumi nella piastra di reazione
Volume per reazione
Componente Reazione del campione di Reazione del controllo Reazione del controllo
RNA positivo negativo
Miscela di reazione 15,0 µL 15,0 µL 15,0 µL
RNA purificato del
campione (ottenuto 10,0 µL — —
nell'estrazione dell’RNA)
Controllo positivo
(TaqPath™ COVID‑19
— 2,0 µL —
Control diluito ottenuto nel
passaggio 3)
Nuclease-free Water — 8,0 µL —
Controllo negativo
purificato (ottenuto — — 10,0 µL
nell'estrazione dell’RNA)
Volume totale 25,0 µL 25,0 µL 25,0 µL
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del
campione introdotto ≤200 µL, piastra di reazione a 384
pozzetti)
Utilizzare questa procedura nelle seguenti condizioni:
• Per l’estrazione è stato utilizzato un volume del campione introdotto originale fino a 200 µL
• Lo strumento è compatibile con le piastre di reazione RT-PCR a 384 pozzetti
1. Se congelati, scongelare i reagenti su ghiaccio.
2. Agitare delicatamente su vortex i reagenti, quindi centrifugarli brevemente per raccogliere il liquido
sul fondo della provetta.
3. Diluire TaqPath™ COVID‑19 Control (1 × 104 copie/µL) fino a ottenere una soluzione madre di 25
copie/µL:
a. Pipettare 98 µL di TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer in una provetta per
microcentrifuga, quindi aggiungere 2 µL di TaqPath™ COVID‑19 Control. Mescolare bene,
quindi centrifugare brevemente.
b. Pipettare 87,5 µL di TaqPath™ COVID‑19 Control Dilution Buffer in una seconda provetta per
microcentrifuga, quindi aggiungere 12,5 µL della soluzione creata al passaggio intermedio 3a.
Mescolare bene, quindi centrifugare brevemente.
24 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoCapitolo 4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR
Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL, piastra di reazione a 384 pozzetti) 4
Nota: TaqPath™ COVID‑19 Control non contiene l'MS2 template.
4. Preparare la miscela di reazione.
a. Per ogni corsa, combinare i seguenti componenti in quantità sufficiente per il numero di
campioni di RNA, più un controllo positivo per piastra RT-PCR real-time a 384 pozzetti e un
controllo negativo per ogni estrazione.
Ad esempio, se su una piastra RT-PCR real-time a 384 pozzetti vengono combinati i campioni
di RNA di 4 estrazioni, su tale piastra RT-PCR real-time a 384 pozzetti devono essere eseguiti
4 pozzetti di controllo negativo.
Tutti i volumi includono un eccesso del 10% per errori di pipettaggio.
IMPORTANTE! I volumi riportati in questa tabella presuppongono che il campione di RNA sia
stato estratto usando un volume del campione introdotto originale di fino a 200 µL.
Volume per n campioni Volume per 379 campioni
Volume per campione di di RNA più y controlli di RNA più 4 controlli
Componente
RNA o controllo negativi più 1 controllo negativi più 1 controllo
positivo positivo
TaqPath™ 1‑Step Multiplex
5,00 µL 5,50 x (n + y + 1) µL 2112,0 µL
Master Mix (No ROX™) (4X)
COVID-19 Real Time PCR
1,00 µL 1,10 x (n + y + 1) µL 422,4 µL
Assay Multiplex
Nuclease-free Water 4,00 µL 4,40 x (n + y + 1) µL 1690,0 µL
Volume totale della
10,0 µL — 4224,4 µL
miscela di reazione
5. Impostare la piastra di reazione:
a. Pipettare 10,0 µL della miscela di reazione preparata al passaggio 4 in ogni pozzetto di una
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode.
Si possono usare piastre senza codice a barre (vedere “Materiali richiesti ma non forniti” a
pagina 10).
b. Agitare delicatamente su vortex la piastra sigillata contenente il campione purificato di
RNA e il controllo negativo ottenuti nella procedura di estrazione dell'RNA, poi centrifugare
brevemente per raccogliere il liquido sul fondo della piastra.
c. Aprire la piastra contenente il campione di RNA purificato e il controllo negativo ottenuti
nella procedura di estrazione dell’RNA. Aggiungere l’RNA del campione, il controllo negativo
o il controllo positivo a ciascun pozzetto della piastra di reazione in base alla Tabella 3 a
pagina 26.
IMPORTANTE! Per impedire la contaminazione dei campioni, aprire una piastra di estrazione
alla volta, quindi richiuderla dopo aver aggiunto i campioni alla piastra di reazione RT-PCR.
TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'uso 25Capitolo 4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR
4 Preparazione delle reazioni di RT‑PCR (volume del campione introdotto ≤200 µL, piastra di reazione a 384 pozzetti)
d. Sigillare accuratamente la piastra con MicroAmp™ Optical Adhesive Film.
IMPORTANTE! Quando si applica il MicroAmp™ Optical Adhesive Film, assicurarsi che la
pressione sia applicata su tutta la piastra e che la sigillatura sia ermetica su ogni singolo
pozzetto. In caso contrario, si corre il rischio che un pozzetto sia sigillato in modo errato, con
conseguente potenziale contaminazione tra un pozzetto e l’altro durante l’agitazione su vortex
ed evaporazione durante la PCR.
e. Agitare su vortex la piastra alla massima impostazione di velocità per 10-30 secondi con
pressione media. Spostare in più punti la piastra per garantire un contatto uniforme sulla
piattaforma dell’agitatore vortex.
IMPORTANTE! Agitare su vortex per 10–30 secondi per una miscelazione appropriata. In
caso contrario, si potrebbe verificare una falsa classificazione dei campioni.
f. Centrifugare la piastra di reazione per 1-2 minuti a ≥650 × g (≥650 RCF) per rimuovere le bolle
e raccogliere il liquido sul fondo della piastra di reazione.
Tabella 3 Volumi nella piastra di reazione
Volume per reazione
Componente Reazione del campione Reazione del controllo Reazione del controllo
di RNA positivo negativo
Miscela di reazione 10,0 µL 10,0 µL 10,0 µL
RNA purificato del campione
(ottenuto nell'estrazione 10,0 µL — —
dell’RNA)
Controllo positivo (TaqPath™
COVID‑19 Control diluito — 2,0 µL —
ottenuto nel passaggio 3)
Nuclease-free Water — 8,0 µL —
Controllo negativo purificato
(ottenuto nell'estrazione — — 10,0 µL
dell’RNA)
Volume totale 20,0 µL 20,0 µL 20,0 µL
26 TaqPath™ COVID‑19 CE‑IVD RT‑PCR Kit Istruzioni per l'usoPuoi anche leggere
